扶正抗癌方抑制非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移及協(xié)同吉非替尼抑制增殖的機制研究.pdf

1、目的:
　　1.探討扶正抗癌方對非小細胞肺癌A549、PC9、H1650細胞株侵襲、遷移的影響，并進一步在基因和蛋白質(zhì)水平探討其可能的分子機制;
　　2.探討扶正抗癌方對非小細胞肺癌吉非替尼原發(fā)性耐藥細胞株A549和繼發(fā)性耐藥細胞株H1650增殖的影響，及其協(xié)同吉非替尼對細胞增殖的影響，并進一步在基因和蛋白質(zhì)水平上探討其可能的分子機制;
　　3.建立裸鼠皮下移植瘤模型，進一步驗證扶正抗癌方及協(xié)同吉非替尼抑制細胞增殖的分

2、子機制。
　　方法:
　　1.采用transwell小室和劃痕實驗檢測扶正抗癌方對A549、PC9、H1650細胞侵襲和遷移能力的影響，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測扶正抗癌方對A549、PC9、H1650細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白，如間質(zhì)細胞的標志蛋白波形蛋白(Vimentin)和神經(jīng)鈣黏素(N-Cadherin)的影響，檢測扶正抗癌方對A549、PC9、H1650細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)通路的信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transd

3、ucers and actibators of transcription3，STAT3)的表達，采用蛋白質(zhì)印跡法和MMP-9活力檢測試劑盒雙重檢測扶正抗癌方對A549、PC9、H1650細胞基質(zhì)金屬蛋白酶家族-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）蛋白質(zhì)和活力的影響，采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法過表達STAT3后，觀察扶正抗癌方在A549、PC9、H1650細胞中對MMP-9活力的影響。
　　2.采用MTS法檢測

4、扶正抗癌方對吉非替尼原發(fā)和繼發(fā)耐藥細胞A549、H1650增殖活力的影響及扶正抗癌方聯(lián)合吉非替尼對A549、H1650增殖活力的影響，采用AnnexinⅤ-FITC/PI流式細胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)檢測扶正抗癌方對A549、H1650細胞凋亡的影響，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測扶正抗癌方對A549、H1650細胞增殖相關(guān)通路Akt（又名蛋白激酶B，PKB）時間依賴性磷酸化蛋白的影響，濃度依賴性檢測扶正抗癌方對A549、H1

5、650細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B(nuclear factor-κ-gene binding)成員p50和p65蛋白及增殖相關(guān)蛋白黏蛋白1(mucin1，MUC1)的影響，通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測扶正抗癌方對A549、H1650細胞MUC1 mRNA的表達水平;采用雙熒光素酶報告基因檢測扶正抗癌方對A549、H1650細胞MUC1啟動子活性的影響;采用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)分別過表達Akt、p65、MUC1后，檢測扶正抗癌方對

6、A549、H1650細胞中其他蛋白及細胞增殖活力的影響，以此來確定信號間的上下游關(guān)系;采用蛋白質(zhì)印跡法檢測扶正抗癌方聯(lián)合吉非替尼對A549、H1650細胞中Akt、p65、MUC1等蛋白的影響，明確兩者協(xié)同效應(yīng)的作用機制。
　　3.建立裸鼠皮下移植瘤模型，分別設(shè)立對照組、扶正抗癌方組、吉非替尼組、扶正抗癌和吉非替尼聯(lián)合給藥組四組，測量各組腫瘤的體積、重量，稱量裸鼠的體重變化，并通過小鼠活體成像技術(shù)觀察不同組別的熒光強度等;通過蛋白

7、質(zhì)印跡法觀察裸鼠移植瘤組織中p-Akt、p65、MUC1等蛋白的變化。
　　結(jié)果:
　　1.分別給予濃度為0、1、2 mg/m;的扶正抗癌方藥液處理后，與對照組相比，穿過transwell小室的細胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05）;用200μ L槍頭對細胞行劃痕處理，分別繼續(xù)培養(yǎng)12h和24h后，與對照組相比，給藥組劃痕寬度更寬（P＜0.05）。
　　2.給予濃度為1，1.5，2 mg/mL扶正抗癌方藥液處理后，weste

8、rn blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Vimentin、N-Cadherin和MMP-9表達下調(diào)，且隨著給藥濃度的增大，下調(diào)作用逐漸增強(P＜0.05); MMP-9活力檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，給藥組MMP-9活力下降，且隨著給藥濃度的增大，抑制作用逐漸增強（P＜0.05）;給予濃度為2 mg/mL的扶正抗癌方藥液處理后，在0.5，2，4，8，24 h時間點處，與對照組相比，給藥組p-STAT3(Tyr705)表達逐漸下調(diào)（P＜0.05

9、）;過表達STAT3后加藥組與單獨加藥組相比，MMP-9活力上調(diào)(P＜0.05)。
　　3.給予濃度分別為0.5，1，1.5，2，2.5，3 mg/mL的扶正抗癌方藥液處理后，分別于24，48，72 h后測定各組細胞活力，與對照組相比，給藥組在各時間點處的細胞活力明顯降低（P＜0.05）;相同時間點處，隨著給藥濃度的增大，細胞活力逐漸降低(P＜0.05);相同給藥濃度，隨著時間的延長，細胞活力亦逐漸降低（P＜0.05）;給予濃度分

10、別為0.5，1，1.5 mg/mL的扶正抗癌方藥液處理，24 h后檢測發(fā)現(xiàn)，隨給藥濃度的增加，細胞早期凋亡和晚期凋亡的比例逐漸增加，而正常細胞的比例逐漸減少（P＜0.05）。
　　4.給予濃度為2 mg/mL的扶正抗癌方藥液處理，0.5，2，4，8，24 h后，給藥組p-Akt(Ser473)蛋白的表達相比對照組均下調(diào)（P＜0.05）;給予濃度分別為0.5，1，1.5，2，2.5 mg/mL的扶正抗癌方藥液處理，24 h后檢測發(fā)現(xiàn)

11、，與對照組相比，給藥組MUC1和p65表達均下調(diào)，且隨給藥濃度的增大，下調(diào)作用逐漸增強（P＜0.05）:給予濃度為2 mg/mL的扶正抗癌方藥液處理后，檢測發(fā)現(xiàn)MUC1 mRNA和MUC1 promotor表達比對照組下調(diào)（P＜0.05）;過表達Akt后加藥組與單獨加藥組相比，p65表達上調(diào)（P＜0.05）;過表達Akt后加藥組與單獨加藥組相比，MUC1表達上調(diào)（P＜0.05）;過表達MUC1后加藥組與單獨加藥組相比，p65表達基本不變

12、（P＞0.05）;過表達MUC1后加藥組與單獨加藥組相比，p-Akt(Ser473)表達上調(diào)（P＜0.05）;過表達MUC1后加藥組與單獨加藥組相比，細胞活力增強（P＜0.05）。
　　5.扶正抗癌方與吉非替尼聯(lián)合給藥組與吉非替尼單獨給藥組相比，細胞活力下降（P＜0.05），p-Akt(Ser473)蛋白表達下調(diào)（P＜0.05），p65蛋白表達下調(diào)（P＜0.05），刪C1蛋白表達下調(diào)（P＜0.05）。
　　6.體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，

13、吉非替尼單獨給藥組與對照組相比，移植瘤的重量、體積和熒光強度差異不明顯（P＞0.05），扶正抗癌方單獨給藥組與對照組相比，移植瘤的重量更輕、體積更小、熒光強度更弱（P＜0.05），聯(lián)合給藥組與吉非替尼單獨給藥組相比，移植瘤的重量更輕、體積更小、熒光強度更弱（P＜0.05）;western blot檢測發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方單獨給藥組與對照組相比，p-Akt(Ser473)、p65和MUC1的表達均下調(diào)(P＜0.05)，聯(lián)合給藥組與吉非替尼單獨

14、給藥組相比，p-Akt(Ser473)、p65和MUC1的表達均下調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.扶正抗癌方以濃度依賴性抑制A549、PC9、H1650細胞的侵襲和遷移;以濃度依賴性下調(diào)間質(zhì)細胞代表物Vimentin和N-Cadherin蛋白的表達，逆轉(zhuǎn)上皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化，從而抑制非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移;以濃度依賴性下調(diào)MMP-9蛋白的表達及MMP-9活力，以時間依賴性下調(diào)p-STAT3(Tyr705)蛋白的表達

15、，且過表達STAT3能逆轉(zhuǎn)扶正抗癌方對MMP-9活力的下調(diào)，表明扶正抗癌方可通過抑制STAT3-MMP9通路抑制非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移。
　　2.扶正抗癌方以濃度和時間依賴性抑制A549細胞和H1650細胞的增殖;以濃度依賴性促進A549細胞和H1650細胞的凋亡;以時間依賴性下調(diào)p-Akt(Ser473)蛋白的表達，以濃度依賴性下調(diào)MUC1蛋白和p65蛋白的表達，過表達Akt可以逆轉(zhuǎn)扶正抗癌方對p65的抑制，過表達p65可以逆轉(zhuǎn)扶正

16、抗癌方對MUC1蛋白的抑制，而過表達MUC1蛋白并不能逆轉(zhuǎn)扶正抗癌方對p65的抑制，因此考慮p65在MUC1的上游，最后我們過表達MUC1逆轉(zhuǎn)扶正抗癌方對p-Akt(Ser473)的抑制，進一步證明我們的假設(shè)是成立的，當過表達MUC1時，逆轉(zhuǎn)了扶正抗癌方對增殖的抑制。表明扶正抗癌方通過Akt-p65-MUC1通路抑制非小細胞肺癌的增殖。
　　3.扶正抗癌方協(xié)同吉非替尼對細胞增殖的抑制效應(yīng)優(yōu)于吉非替尼單藥，其作用機制亦是通過抑制Ak