淫羊藿素通過誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡延緩大鼠肝纖維化進(jìn)程.pdf

1、[研究目的]
　　 探討淫羊藿素通過誘導(dǎo)活化型肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells，HSCs)的生長抑制和凋亡，延緩大鼠肝纖維化進(jìn)程的作用和機(jī)制。
　　 [研究方法]
　　 體外實驗：以不同濃度的淫羊藿素及其溶劑分別處理肝星狀細(xì)胞系HSC-T6(大鼠)、LX-2(人)和正常人肝細(xì)胞系，應(yīng)用噻唑藍(lán)測定各受試細(xì)胞的生長周期變化。應(yīng)用流式細(xì)胞儀及AnnexinV-FITC染色試劑盒等技術(shù)檢測淫羊藿素

2、對HSCs的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。并采用全基因組表達(dá)譜芯片對淫羊藿素處理后的HSC-T6以及溶劑處理的HSC-T6進(jìn)行全基因組表達(dá)譜的比較分析，初步檢測淫羊藿素作用下HSCs凋亡的相關(guān)通路。并通過Real-time PCR及Western blot檢測淫羊藿素處理后細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-12、caspase-3和BAX的表達(dá)，以初步探索淫羊藿素抗肝纖維化作用及誘導(dǎo)活化型HSCs凋亡的分子機(jī)制。
　　 體內(nèi)實驗：通過膽總管結(jié)扎

3、手術(shù)(Common bile duct ligation，CBDL)以及四氯化碳(Carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)分別建立膽汁淤積性肝硬化模型和肝中毒損傷性肝硬化模型。在大鼠肝纖維化形成后，給予淫羊藿素治療(1 mg]kg體重，3次/w，持續(xù)4 w)。治療結(jié)束后，取大鼠右心室全血檢測肝功能指標(biāo)的變化，病理切片HE染色觀察肝臟損傷程度。通過免疫組化α-SMA染色分析及Western blot方法檢測肝臟纖維膠原積累

4、情況及組織內(nèi)活化型HSCs的分布和密度，并進(jìn)一步測定肝組織羥脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)含量，檢測淫羊藿素對膽汁淤積性肝纖維化和氧化損傷肝纖維化的緩解作用。各項數(shù)據(jù)通過(-x±s).d表示，并采用統(tǒng)計專業(yè)軟件PASW18.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。顯著性差異分析采用一維方差分析的LSD多重比較及獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [實驗結(jié)果]
　　 體外實驗：HSC-T6對淫羊藿

5、素反應(yīng)敏感。淫羊藿素對HSC-T6生長的48 h半數(shù)抑制濃度(IC50)為12.8μmol/L。并且隨著淫羊藿素濃度的增加，生長抑制作用逐漸增強(qiáng)，具有劑量依賴性。但對正常肝細(xì)胞無明顯毒副作用。淫羊藿素對活化型HSCs的生長抑制主要通過誘導(dǎo)凋亡實現(xiàn)。HSC-T6與24μmol/L淫羊藿素共培養(yǎng)24 h后，凋亡率為20.19％，與正常培養(yǎng)活化型肝星狀細(xì)胞比較差異顯著(P＜0.05)。并伴隨G2期細(xì)胞消失。淫羊藿素誘導(dǎo)LX-2的凋亡趨勢更明顯

6、。全基因組表達(dá)譜芯片掃描結(jié)果顯示，淫羊藿素誘導(dǎo)活化型肝星狀細(xì)胞凋亡，顯著改變Bcl-2家族相關(guān)凋亡基因表達(dá)，并且上調(diào)Bax、caspase-3和caspase-12等蛋白表達(dá)水平，參與線粒體凋亡通路的調(diào)控。
　　 體內(nèi)實驗顯示：與模型組比較，淫羊藿素治療組能夠降低肝纖維化時異常升高的轉(zhuǎn)氨酶水平(P＜0.05)，大鼠肝纖維化評分明顯降低(P＜0.05)。Ⅰ型膠原及α-SMA染色顯示模型組在肝內(nèi)毛細(xì)膽管附近有大量的活化型HSCs存在

7、。淫羊藿素組活化型HSCs數(shù)量(P＜0.05)、膠原蛋白及Hyp含量(P＜0.01)均顯著下降。因此，淫羊藿素可減少纖維化肝組織中活化型HSCs的數(shù)目及膠原蛋白的堆積，延緩肝纖維化進(jìn)程。淫羊藿素抗肝纖維化作用通過誘導(dǎo)活化型HSCs凋亡實現(xiàn)。
　　 [結(jié)論]
　　 1、淫羊藿素可抑制體外培養(yǎng)的活化型肝星狀細(xì)胞系HSC-T6(大鼠)及LX-2(人)的生長，但對正常肝細(xì)胞系生長無明顯抑制作用。
　　 2、淫羊藿素可誘導(dǎo)