熊去氧膽酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡與Livin、Smac表達異常有關(guān).pdf

1、肝細(xì)胞肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國發(fā)病率高，病死率亦高。普遍認(rèn)為肝癌的發(fā)生是多因素、多途徑、多步驟長期作用的結(jié)果，其中細(xì)胞凋亡及抗凋亡機制的影響在肝癌的始動、促動、進展等各個階段起到了十分重要的作用。調(diào)控肝癌細(xì)胞的凋亡對肝癌的綜合防治有著十分重要的意義。熊去氧膽酸廣泛應(yīng)用于臨床用以治療肝膽疾病，其通過多種途徑保護肝細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，熊去氧膽酸對肝癌細(xì)胞具有選擇性誘導(dǎo)凋亡的作用。熊去氧膽酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機制尚不明確。有研究提出熊去

2、氧膽酸促進乳腺癌細(xì)胞凋亡是通過非p53依賴的途徑，而對肝癌細(xì)胞的研究顯示熊去氧膽酸通過上調(diào)Bax/bcl-2基因的表達促進其凋亡。
　　Livin是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡相關(guān)因子，Livin在腫瘤組織中往往選擇性高表達，而Smac作為一種具促凋亡功能的因子則往往低表達甚至缺失。Livin的高表達、Smac的低表達促進了肝癌的發(fā)展，二者關(guān)系可能是肝癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的重要一環(huán)。本研究著眼于證實熊去氧膽酸可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，并通過

3、檢測熊去氧膽酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡時細(xì)胞周期的變化及Bax、bcl-2、Livin、Smac等凋亡相關(guān)因子表達的變化探討熊去氧膽酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的可能機制，最后轉(zhuǎn)染Livin反義寡核苷酸觀察對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，從而為使用Livin、Smac等基因作為腫瘤治療的新靶點提供理論依據(jù)。
　　材料與方法:
　　1、實驗材料
　　HepG2肝癌細(xì)胞株、Chang氏肝細(xì)胞株來源于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室細(xì)胞庫，RP

4、MI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于Hyclone公司，熊去氧膽酸、四氮唑藍(MTT)均購自Sigma公司，ANNEXIN V/PI試劑盒購自BD公司，脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒購自Beyotime公司，小鼠抗人Bax單克隆抗體、小鼠抗人bcl-2單克隆抗體、即用型MaxVisionTM二抗均購自Maxim公司，兔抗人Livin單克隆抗體、小鼠抗人Smac單克隆抗體購自Cell Signaling Tec

5、hnology公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔、FITC標(biāo)記羊抗小鼠二抗購自Jackson公司，Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，Caspase-3活性檢測試劑盒購自Beyotime公司，RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司，PrimeScript(@) RTreagent Kit試劑盒、SYBR(@) Primix Ex TaqTM試劑盒均購自TAKARA公司。
　　2、實驗方法
　　倒置相差

6、顯微鏡觀察熊去氧膽酸作用后細(xì)胞形態(tài)變化，細(xì)胞增殖抑制試驗采用MTT法，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化，ANNEXIN V/PI染色以及TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。Bcl-2、Bax蛋白的表達采用免疫細(xì)胞化學(xué)，Livin、Smac蛋白的表達采用免疫熒光化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)及Western-blot方法。實時熒光定量PCR法檢測Livin、Smac及caspase-3 mRNA的表達。分光光度法測定caspase-3的活性。
　　3、統(tǒng)計學(xué)方

7、法
　　采用SPSS18.0軟件，對定量數(shù)據(jù)資料進行t檢驗及ANOVA單因素方差分析。
　　結(jié)果:
　　一、不同濃度熊去氧膽酸對肝癌細(xì)胞株增殖和凋亡的影響
　　1、倒置相差顯微鏡觀察不同濃度UDCA作用于HepG2細(xì)胞的形態(tài)變化
　　與正常HepG2細(xì)胞相比，加入不同濃度UDCA后，細(xì)胞體積變小、變形，貼壁細(xì)胞皺縮，部分細(xì)胞脫落、變圓。另外，隨著UDCA濃度增大，細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化越明顯。
　　2、MT

8、T法對細(xì)胞增殖抑制的時間、濃度分析
　　向?qū)?shù)生長的HepG2細(xì)胞加入濃度分別為0.25、0.5、0.75和1.0mmol/L作用24、48、72小時后細(xì)胞增殖抑制率隨著UDCA濃度升高以及作用時間延長，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，有顯著性差異。
　　3、流式細(xì)胞儀檢測不同濃度UDCA對細(xì)胞周期的影響
　　隨著UDCA作用濃度的升高，G0-G1期細(xì)胞比例逐漸較少，而S期細(xì)胞逐漸增多，尤其以48小時時變化更為明顯。對照組S期

9、細(xì)胞比例為18.96％，0.75mmol/LUDCA作用后S期細(xì)胞比例達到90.87％，同時G0-G1期細(xì)胞比例由67.45％下降到7.13％。UDCA作用24小時的變化趨勢與48小時時相同。
　　4、流式細(xì)胞儀ANNEXIN V/PI對不同時間及不同濃度UDCA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果
　　流式細(xì)胞儀檢測不同濃度UDCA作用于HepG2細(xì)胞觀察凋亡率的變化，無論作用24小時還是48小時，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，與對照組相比，

10、作用24小時時0.25mmol/L、0.50mmol/L、0.75mmol/L終濃度的UDCA凋亡率分別為3.71±1.89％、6.87±2.02％、10.03±-2.46％;而48小時凋亡率分別為9.13±2.19％、18.88±2.49％、23.95±3.21，與對照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。
　　5、TUNEL法檢測不同濃度UDCA作用于HepG2細(xì)胞24小時后凋亡
　　TUNEL檢測試劑盒觀察UDCA作用

11、24小時后HepG2細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光為凋亡細(xì)胞，同一視野光鏡觀察檢測區(qū)域細(xì)胞總數(shù)。隨著UDCA濃度的升高，綠色熒光細(xì)胞逐漸增多。尤其以0.75mmol/L終濃度的UDCA作用時最明顯。TUNEL試劑盒檢測UDCA作用于HepG2細(xì)胞24小時后凋亡率的變化，通過流式細(xì)胞儀定量分析，對照組凋亡率僅為0.02±0.005％，而0.25mmol/L、0.50mmol/L、0.75mmol/L組凋亡率分別為8.82±0.28

12、％、20.06±1.44％、26.78±1.63％，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。
　　二、UDCA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡時Bax、 bcl-2、Livin、Smac等凋亡相關(guān)因子的表達
　　1、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測不同濃度UDCA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡時Bax、bcl-2、Livin、Smac蛋白的表達
　　免疫細(xì)胞化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)對照組HepG2細(xì)胞表達bcl-2、Livin蛋白，呈現(xiàn)出棕色顆粒染色細(xì)胞，定位于

13、細(xì)胞質(zhì)。隨著UDCA作用濃度的升高，染色陽性細(xì)胞逐漸減少，計算標(biāo)記系數(shù)發(fā)現(xiàn)bcl-2和Livin蛋白的表達率逐漸下降，相對于對照組Livin蛋白的表達，0.25、0.5、0.75mmol/L終濃度UDCA作用后，Livin蛋白的表達率分別為47.7±1.1％、41.0±2.3％、14.5±2.3％，bcl-2的表達也表現(xiàn)出相同的趨勢。與之相反，Bax及Smac的表達隨著UDCA濃度的升高逐漸升高，0.25、0.5、0.75mmol/L終

14、濃度UDCA作用后，Smac蛋白的表達率分別為36.2±2.6％、60.0±3.1％、71.5±1.6％，與對照組的10.4±1.8％相比均有顯著性差異(P＜0.01)。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測不同濃度UDCA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡時Livin、Smac熒光標(biāo)記率
　　流式細(xì)胞儀檢測不同濃度UDCA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞48小時后凋亡的變化，對照組Livin蛋白的熒光標(biāo)記率為8.51±0.77％，隨著UDCA濃度的升高，Livi

15、n蛋白的熒光標(biāo)記率逐漸下降，0.25、0.50、0.75mmol/L終濃度的UDCA作用后Livin蛋白的表達率分別為4.01±0.66％、1.200.31％、0.84±0.12％。而Smac蛋白的熒光標(biāo)記率逐漸升高，與對照組相比，具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　3、Caspase-3活性測定
　　按照試劑盒要求制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，提示pNA濃度與吸光度值成正相關(guān)，即吸光度值越高，其pNA濃度越高，Caspase-3活性越高

16、。UDCA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡時caspase-3活性測定采用吸光度值表示，與標(biāo)準(zhǔn)曲線相對比，吸光度值越高代表pNA濃度越高，亦即caspase-3活性越高，因此可以采用吸光度值代表caspase-3活性。UDCA作用于HepG2細(xì)胞24小時、48小時后測定的吸光度值隨著UDCA濃度的升高而逐漸升高，代表caspase-3活性越來越高，與對照組對比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、實時熒光定量PCR檢測不同濃度UDCA誘導(dǎo)

17、HepG2細(xì)胞凋亡時凋亡相關(guān)因子Livin、Smac及caspase-3mRNA表達的變化
　　Livin、Smac、Caspase-3特異性擴增產(chǎn)物分別對應(yīng)熔解溫度Tm值為（87.49±0.69）℃、（83.45±1.41）℃、(86.53±0.16)℃，熔解曲線單峰無雜帶。熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線中， Livin、Smac、Caspase-3及β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率slope分別為-1.674、-1.682、-1.551

18、及-1.677，縱截距分別為35.34、36.01、35.22及35.38，相關(guān)系數(shù)R2均為0.9801。UDCA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡24小時、48小時后實時熒光定量PCR檢測Livin mRNA、Smac mRNA及caspase-3 mRNA表達的變化，隨著UDCA濃度的升高，Livin mRNA相對表達量逐漸下降，而SmacmRNA、caspase-3 mRNA表達量相對增加，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。
　

19、　5、western-blot測定UDCA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡24小時、48小時后Livin、Smac蛋白的表達
　　Western-blot測定UDCA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡24小時、48小時后Livin、Smac蛋白的表達，隨著UDCA濃度的升高，Livin表達量呈下降趨勢，而Smac正好相反，在對照組不表達，隨著作用濃度的升高Smac蛋白開始表達，并呈現(xiàn)出升高的趨勢。
　　三、Livin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞增殖

20、和凋亡的變化
　　1、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染LivinmRNAASODN后Livin蛋白的表達
　　免疫細(xì)胞化學(xué)檢測Livin在對照組中呈陽性表達，分析Livin陽性表達的標(biāo)記系數(shù)為50.5±7.2％。轉(zhuǎn)染Livin基因MSODN后，Livin蛋白的表達無變化。而轉(zhuǎn)染Livin基因ASODN后，Livin蛋白表達明顯減少，標(biāo)記系數(shù)為10.7±1.6％，與對照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。
　　2、L

21、ivinmRNA的ASODN、MSODN轉(zhuǎn)染后Livin蛋白表達的熒光標(biāo)記率
　　流式細(xì)胞儀檢測Livin蛋白的免疫熒光標(biāo)記率，對照組標(biāo)記率為8.81±0.21％，轉(zhuǎn)染ASODN、MSODN后標(biāo)記率分別為8.76±0.19％及1.84±0.14％，與對照組相比，MSODN組無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而轉(zhuǎn)染ASODN后，Livin表達明顯下降，有著顯著性差異(P＜0.01)。
　　3、實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后Livin

22、 mRNA的表達
　　Livin特異性擴增產(chǎn)物對應(yīng)熔解溫度Tm值為（84.71±0.12）℃，熔解曲線單峰無雜帶。熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，Livin標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率slope為-1.617，縱截距為30.14，相關(guān)系數(shù)R2為0.9801。轉(zhuǎn)染以Livin為靶點的ASODN后，LivinmRNA相對表達量為0.1868±00.0880，而MSODN組為2.4715±0.2490，與對照組相比，轉(zhuǎn)染ASODN組有顯著性差異(P＜0.0

23、5)，而MSODN組沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4、流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的變化
　　轉(zhuǎn)染Livin mRNA的ASODN后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，S期細(xì)胞減少，而G0-G1期細(xì)胞相對增多。
　　5、Annexin V/PI檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率變化
　　轉(zhuǎn)染Livin基因ASODN、MSODN后，Annexin V/PI法流式細(xì)胞儀檢測HepG2細(xì)胞凋亡率分別為19.72±1.22％及6.31±1.61％，而對

24、照組凋亡率為5.52±0.01％，轉(zhuǎn)染Livin基因ASODN后，HepG2細(xì)胞凋亡率明顯增加，有顯著性差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、熊去氧膽酸可以抑制肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞增殖，其與HepG2細(xì)胞被阻滯于S期有關(guān)。
　　2、熊去氧膽酸誘導(dǎo)HepG2凋亡呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性。
　　3、熊去氧膽酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡時bcl-2蛋白、Livin蛋白表達下調(diào)，而Bax蛋白、Smac蛋白表達上調(diào)。

25、r>　　4、熊去氧膽酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡時Livin mRNA表達下調(diào)，而Smac mRNA及caspase-3 rnRNA表達上調(diào)，同時caspase-3活性增強。
　　5、熊去氧膽酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡可能與Livin表達下調(diào)、Smac表達上調(diào)，Smac結(jié)合Livin后釋放出更多且活性更強的caspase-3有關(guān)。
　　6、轉(zhuǎn)染以Livin為靶點的反義寡核苷酸序列后，HepG2細(xì)胞表達Livin蛋白及LivinmRNA均下降。