HBX在TRAIL誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、目的：探討乙型肝炎病毒X基因(hepatitis B virus X gene，HBX)促TRAIL誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制，為揭示HBX的致病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：(1)克隆人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL)基因片段并克隆入原核表達(dá)載體pET30a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a(+)/TRAIL，

2、經(jīng)測(cè)序正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)化蛋白表達(dá)條件，提取并純化His-TRAIL蛋白，鑒定其生物學(xué)活性。(2)培養(yǎng)Huh7、Huh7-3.1、Huh7-HBX細(xì)胞，將3000ng/ml His-TRAIL作用于各組細(xì)胞48h后，采用CCK8、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況;免疫熒光、Western blot檢測(cè)細(xì)胞死亡受體DR4和DR5表達(dá)的變化;分光亮度法檢測(cè)細(xì)胞caspase8、caspase3活性的變化。(3)收集臨

3、床病人肝癌標(biāo)本（HBV陽(yáng)性及HBV陰性），免疫組織化學(xué)檢測(cè)HBX、DR4和DR5的表達(dá)，觀察HBX對(duì)DR4、DR5表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：(1)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a(+)/TRAIL，誘導(dǎo)表達(dá)后收集的TRAIL蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳、Western blot結(jié)果顯示為可溶性的His-TRAIL，鎳離子親和層析柱分離純化獲得目的蛋白。CCK8結(jié)果顯示His-TRAIL蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞具有促凋亡作用而對(duì)正常肝細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒

4、作用。(2) CCK8結(jié)果顯示，Huh7-HBX組的細(xì)胞增殖情況與Huh7-3.1組和Huh7細(xì)胞相比均顯著降低(P＜0.05）;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，Huh7-HBX組的細(xì)胞凋亡率較Huh7-3.1和Huh7組細(xì)胞均顯著提高(P＜0.05）;免疫熒光、Western blot證實(shí)HBx蛋白能夠提高Huh7細(xì)胞死亡受體(death receptor) DR4、DR5的表達(dá)量;caspase活性檢測(cè)結(jié)果顯示，在His-TRAIL的作用下

5、，HBX能顯著提高Huh7細(xì)胞caspase8、caspase3的活性（P＜0.05）。(3)臨床肝癌標(biāo)本免疫組織化學(xué)顯示HBV感染的病人有HBx的表達(dá)，并且在有HBx表達(dá)的肝癌組織中DR4、DR5的表達(dá)有所增加。
　　結(jié)論：(1)成功構(gòu)建表達(dá)可溶性、具有生物學(xué)活性的TRAIL蛋白原核表達(dá)載體pET30a(+)/TRAIL。(2) HBX能夠促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)細(xì)胞DR4、DR5的表達(dá)從而激活死亡