蜂毒素協(xié)同TRAIL誘導(dǎo)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究目的及背景： 肝癌是世界第五大癌癥，每年有上百萬人死于肝癌，我國(guó)為世界上肝癌的高發(fā)區(qū)，原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，占癌癥死亡率的第二位。目前對(duì)肝癌的主要治療方法是早期進(jìn)行手術(shù)切除，但在我國(guó)，由于多數(shù)肝癌的發(fā)現(xiàn)均較晚或早期即有肝內(nèi)播散；肝癌病人多伴較重肝硬化，肝功能異常；年齡或其他疾病的限制等，使臨床肝癌手術(shù)切除治療受到很大限制，并且肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率也很高，也極大的影響患者的生存。此外，放療、介入治療和肝移植等治療方法

2、雖然取得一定進(jìn)展，但是總體療效仍然不能令人滿意，且在應(yīng)用中受到諸多禁忌癥的限制。一方面可能與肝癌細(xì)胞的多耐藥基因有關(guān)，但更重要的原因是因?yàn)楦伟┑陌l(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟多因素的過程，涉及到細(xì)胞內(nèi)的一系列復(fù)雜的生物學(xué)變化。細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制紊亂是腫瘤發(fā)生的主要原因，即在某些致癌因素的作用下或細(xì)胞內(nèi)基因突變發(fā)生突變，導(dǎo)致促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的信號(hào)通路異常活化，從而引起分化不成熟的細(xì)胞異常增生，而促進(jìn)細(xì)胞有序凋亡和成熟分化的信號(hào)通路受到抑制，細(xì)胞異

3、常存活，細(xì)胞增殖和死亡調(diào)控信號(hào)失衡，從而導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。這是一個(gè)多因素共同作用和多步驟致瘤的緩慢過程。其機(jī)理涉及原癌基因的活化、抗癌基因的失活、生長(zhǎng)增殖信號(hào)的持續(xù)作用、死亡信號(hào)衰減或抑制、細(xì)胞周期異常及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增生等多個(gè)環(huán)節(jié)。此外，肝癌的發(fā)生還和病毒感染密切相關(guān)。由于肝癌的發(fā)生和發(fā)展涉及到多因素、多途徑的共同作用，因此，僅針對(duì)肝癌發(fā)生機(jī)制中某一因素的單一藥物治療效果不夠理想。因而，在深入研究肝癌形成、發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，在分子

4、水平明確肝癌細(xì)胞各種生長(zhǎng)調(diào)控因素間的動(dòng)態(tài)平衡的基礎(chǔ)上，針對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展中多個(gè)環(huán)節(jié)，探索能夠特異性抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物或能夠聯(lián)合抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的藥物組合并揭示其作用機(jī)制是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一，對(duì)于我國(guó)這樣一個(gè)肝癌的高發(fā)國(guó)度而言，更是具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值，具有潛在的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)和社會(huì)效應(yīng)。 TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand，人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體)是腫

5、瘤壞死因子超家族的成員之一，TRAIL蛋白是一種Ⅱ型糖蛋白，分為細(xì)胞外C端區(qū)域、跨膜區(qū)、胞內(nèi)N端區(qū)域三個(gè)部分，其C末端的胞外區(qū)與TNF家族的其它成員具有較高的同源性，TRAIL通過與特異性受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能，目前發(fā)現(xiàn)的TRAIL受體有5種：TRAIL-R1/DR4、TRAIL-R2/DR5、TRAIL-R3/DcR1、TRAIL-R4/DcR2和OPG。按其功能和結(jié)構(gòu)可分為三類：(1)死亡受體：DR4和DR5；(2)誘騙受體：DcR

6、1和DcR2；(3)可溶性受體OPG。其中，介導(dǎo)凋亡的主要是死亡受體DR4和DR5。TRAIL通過與其活化型受體DR4或DR5的胞外段結(jié)合，引起受體的三聚作用并使胞內(nèi)段的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)活化，并通過其死亡結(jié)構(gòu)域募集胞漿死亡信號(hào)傳遞蛋白FADD，F(xiàn)ADD進(jìn)而活化caspase-8和caspase-10等凋亡執(zhí)行分子，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷，同時(shí)，TRAIL信號(hào)通過影響B(tài)cl-2家族分子，破壞線粒體膜的完整性，既而引起線粒體內(nèi)cytochrome

7、 c及Smac/DIABLO的釋放，凋亡小體的形成，從而引起DNA的斷裂。TRAIL除可引起凋亡信號(hào)的活化，還可以通過激活TRAF2(TNF受體相關(guān)因子2)，引起下游RIP、TAK1等分子的活化，最后引起MAPK和NFkB信號(hào)通路的活化。放療或化療通常是通過P53基因的激活來達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，由于很多人腫瘤細(xì)胞包括肝癌細(xì)胞中P53基因是缺失或突變的，因而很多腫瘤對(duì)于放療或化療不敏感。TRAIL誘導(dǎo)的凋亡并不依賴于P53的活化，其能

8、夠在體內(nèi)外誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡但對(duì)正常組織細(xì)胞無明顯影響，是常用的凋亡誘導(dǎo)及基因治療模型，其重組細(xì)胞因子已應(yīng)用于某些腫瘤的臨床前實(shí)驗(yàn)及臨床治療，具備良好的應(yīng)用前景25。但是，大多數(shù)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡并不敏感，限制了其在人肝癌治療中的應(yīng)用。因而，尋找能夠特異性增強(qiáng)TRAIL凋亡誘導(dǎo)作用的藥物是目前國(guó)際腫瘤基因治療研究的熱點(diǎn)之一，受到國(guó)際學(xué)術(shù)界相關(guān)領(lǐng)域的關(guān)注。面對(duì)這一狀況，我國(guó)豐富的中藥資源是我們的優(yōu)勢(shì)之一，很多動(dòng)植物中提

9、取的生物活性成分都被證實(shí)有抗肝癌作用，并被廣泛應(yīng)用于臨床。因此，尋找新的生物活性成分，探索其抗腫瘤機(jī)理并研究其與TRAIL的協(xié)同誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)是一項(xiàng)具有一定理論意義和應(yīng)用前景的工作?；诒究剖乙酝ぷ鞯幕A(chǔ)上，我們選擇蜂毒的有效活性成分蜂毒素單體作為了研究對(duì)象。 蜂毒素(melittin)是蜂毒的主要活性成分，約占蜂毒干質(zhì)量的50％。蜂毒素單體是經(jīng)現(xiàn)代工藝從蜂毒中提取的有效活性成分，純度可達(dá)99％以上。它是由26個(gè)氨基酸組成的堿性

10、多肽，其N端和C端分別具有疏水和親水的生化基團(tuán)，具有典型的兩性分子結(jié)構(gòu)，具有很好的水溶性，能夠和細(xì)胞膜上的磷脂相互作用，在以往的研究中經(jīng)常作為細(xì)胞膜上脂-蛋白相互作用的模型。蜂毒素是Ca2+-ATP酶、H+K+-ATP酶、Na+K+-ATP酶的抑制劑，可以抑制GTP結(jié)合蛋白的內(nèi)在活性，近年來，隨著蜂毒分離、提取、純化技術(shù)的不斷提高，對(duì)蜂毒素的功能及作用機(jī)制的研究也日益廣泛。目前的研究主要集中在蜂毒素的抗炎作用上，有研究表明蜂毒素能夠通過

11、與NF-kB上游的IkB作用從而抑制NF-kB的活性發(fā)揮抗炎作用；也有報(bào)道認(rèn)為蜂毒素能夠通過與NF-kB的P50亞基相互作用從而起到抗炎效應(yīng)；在骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞中能夠通過抑制MMP-3從而減少炎性因子的分泌。有研究顯示報(bào)道去除蜂毒素C端12-26位的谷氨酰氨殘基可以增強(qiáng)它的抗炎活性；蜂毒素對(duì)體內(nèi)外支原體和衣原體引起感染也均有抑制作用；也有研究表明蜂毒素對(duì)某些腫瘤細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，如蜂毒素可以通過抑制NF-kB和Akt的活性并上調(diào)凋

12、亡相關(guān)蛋白的表達(dá)從而誘導(dǎo)鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡，可以引起Ca2+內(nèi)流繼而導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞MG63凋亡。本科室以往的工作曾對(duì)蜂毒素的生物學(xué)活性有初步研究，證明攜帶蜂毒素的重組腺病毒在體外能夠肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，蜂毒素可通過抑制Racl依賴的信號(hào)通路在體內(nèi)外抑制肝癌的轉(zhuǎn)移。那么，蜂毒素能否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡?蜂毒素是否與TRAIL具有協(xié)同效應(yīng)?在既往工作的基礎(chǔ)上，我們對(duì)蜂毒素單體對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示蜂毒素單體對(duì)人肝

13、癌細(xì)胞hepG2的生長(zhǎng)有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用，且這種作用存在明顯的時(shí)間和濃度依賴性。此外，我們發(fā)現(xiàn)，在5ug/ml的蜂毒素協(xié)同作用下，低濃度(50ng/ml)的TRAIL即可引起TRAIL不敏感肝癌細(xì)胞株hepG2出現(xiàn)明顯凋亡，相比于單獨(dú)的蜂毒素處理組和TRAIL處理組差異顯著。因此，我們初步推測(cè)蜂毒素能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，并與TRAIL具有協(xié)同效應(yīng)，能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。本課題擬針對(duì)這一設(shè)想進(jìn)行研究，探討蜂毒素與TRAI

14、L協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。主要研究目的為： 1、明確蜂毒素對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)及其機(jī)制。2、探討蜂毒素能否增強(qiáng)與肝癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性及其分子機(jī)制。3、觀察蜂毒素與TRAIL協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的體內(nèi)效應(yīng)。 二、研究方法： 1、流式細(xì)胞儀檢測(cè)蜂毒素誘導(dǎo)hepG2細(xì)胞凋亡的效應(yīng)及其時(shí)間劑量關(guān)系，western-blot、激酶分析法及報(bào)告基因方法檢測(cè)凋亡及生長(zhǎng)增殖相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子的變化，

15、并使用相應(yīng)信號(hào)通路的抑制劑處理細(xì)胞以改變?cè)撔盘?hào)通路的活化狀況，觀察凋亡效應(yīng)的變化，明確相應(yīng)信號(hào)通路與蜂毒素誘導(dǎo)的凋亡效應(yīng)的關(guān)系，探討其分子機(jī)制。 2、分別設(shè)立不加刺激的對(duì)照組、蜂毒素單獨(dú)處理組、TRAIL單獨(dú)處理組及協(xié)同作用組，作用HepG2細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的差異，觀察蜂毒素能否增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性，并檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路的改變，干預(yù)其活化狀態(tài)，明確其與蜂毒素與TRAIL可能的協(xié)同效應(yīng)的關(guān)系，探討蜂毒

16、素與TRAIL可能的協(xié)同效應(yīng)的作用環(huán)節(jié)及機(jī)理。3、建立裸鼠荷瘤模型，通過小鼠尾靜脈途徑給藥的方法，分別設(shè)立TRAIL單獨(dú)處理組(10mg/kg)、蜂毒素低劑量組(50ug/kg)、蜂毒素高劑量組(100ug/kg)及協(xié)同作用組(TRAIL10mg/kg+蜂毒素50ug/kg)，以注射PBS小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，觀察各組間腫瘤大小的差異，觀察蜂毒素與TRAIL的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。 三、研究結(jié)論： 結(jié)論：綜上所述，我們檢測(cè)了中藥單