HBV編碼蛋白HBx通過核基質結合蛋白SATB1誘導肝癌細胞失巢凋亡抵抗的作用機制研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌(primary liver cancer)是常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率逐年上升,其中約一半發(fā)生在中國。大多數(shù)肝癌為肝細胞癌(HCC),而HBV感染是世界公認的原發(fā)性肝細胞癌的主要病因和促轉移因素。HCC易出現(xiàn)早期轉移,血清HBV DNA水平較高的HCC患者轉移及死亡的風險更高。在惡性腫瘤細胞轉移的過程中,脫落腫瘤細胞能抵抗失巢凋亡,這是轉移的早期重要事件和先決條件,是轉移性腫瘤細胞的標志性特征。有研究表明,SATB1通

2、過錨著特異性的DNA序列并招募染色質重組復合體來調控基因的表達,進而促進腫瘤生長及轉移。在轉移性乳腺癌細胞株中沉默SATB1的表達后,錨著非依賴性生長被抑制并誘導細胞發(fā)生失巢凋亡。我們研究的目的是明確HBV、SATB1及肝癌細胞失巢凋亡之間的關系及其具體調控機制
　　方法：我們收集了40對肝癌組織及相應癌旁組織標本(20對HBV相關性肝癌及癌旁標本,20對無HBV感染的肝癌及癌旁標本),用實時定量PCR及western blot檢

3、測了肝癌及相應癌旁組織、5株不同轉移潛能肝癌細胞株(2株HBV DNA陽性細胞Hep3B和HepG2.2.15,以及3株HBV DNA陰性細胞SK-HEP-1, HepG2和SMMC-7721)中SATB1的表達差異,以觀察SATB1與肝癌轉移及HBV感染等相關臨床病理特征的關系;用包含HBV全基因組的質粒pBlue-HBV(可編碼產(chǎn)生HBV各種蛋白)轉染低表達SATB1的肝癌細胞株HepG2,并檢測轉染前后細胞中SATB1的表達及細胞

4、失巢凋亡和軟瓊脂單克隆形成情況,進一步研究HBV、SATB1和失巢凋亡之間的關系;將7種HBV編碼基因的質粒及空載體分別轉入HepG2肝癌細胞,檢測轉染前后細胞中SATB1的表達,以篩選出調控SATB1表達的具體HBV編碼蛋白;然后用包含此病毒基因的載體進一步穩(wěn)定轉染HepG2及Hep3B細胞,檢測轉染前后細胞中SATB1的表達、失巢凋亡和軟瓊脂單克隆形成情況,以明確HBV編碼蛋白在HBV調控SATB1表達及肝癌細胞抗失巢凋亡效應中的作

5、用;用PI-3K、JNK、ERKs和P38 MAPK信號分子的抑制劑分別處理細胞,以篩選HBV編碼蛋白調控SATB1表達及細胞失巢凋亡抵抗的具體信號通路;然后用羅丹明標記的活化caspases檢測試劑盒檢測各組細胞中caspase-3, caspase-8和caspase-9的表達,并檢測死亡受體標記蛋白FADD的表達差異,以明確SATB1抑制失巢凋亡的具體凋亡通路。
　　結果：在40對肝癌及相應癌旁組織中,有22對(55％)標本

6、的癌組織中SATB1的表達顯著高于(≥2.0-fold)相應癌旁組織;并且,SATB1的高表達與 HBV感染(p<0.05)、腫瘤大小(p<0.05)、分化程度(p<0.05)、門脈轉移(p<0.05)及淋巴結轉移(p<0.05)相關。此外,SATB1在包含 HBV全基因組的HepG2.2.15細胞及高轉移潛能肝癌細胞株 SK-HEP-1中高表達(以低轉移潛能的Hep3B細胞為對照,△CT值:7.36±0.08 vs10.27±0.06

7、;7.46±0.09 vs10.27±0.06;**P<0.01)。用pBlue-HBV質粒轉染低表達 SATB1的HepG2細胞后,SATB1表達增高(△CT:7.01±0.03 vs9.59±0.02;**p<0.01),失巢凋亡率降低(22.68±1.25％ vs35.51±0.86％;**p<0.01),軟瓊脂單克隆形成增加(24.89±2.23％ vs2.11±1.02％;**p<0.01)。增強或沉默肝癌細胞中SATB1的表

8、達后,脫落肝癌細胞抵抗失巢凋亡的能力也隨之被增強(失巢凋亡率:21.20±0.81％ vs31.79±0.88％;克隆形成率:22.09±1.84％ vs10.67±1.14％;**p<0.01)或抑制(失巢凋亡率:40.51±1.81％ vs27.48±0.79％;克隆形成率:4.91±0.76％vs17.98±1.57％;**p<0.01)。將7個構建的病毒基因質粒及pEGFP-N1空載體分別轉入 HepG2肝癌細胞中,結果顯示 H

9、BV編碼蛋白 HBx能顯著上調 SATB1的表達(△CT:7.69±0.07 vs10.02±0.03;**p<0.01)。用pEGFP-N1-HBx質粒穩(wěn)定轉染 HepG2和Hep3B細胞,結果表明 HepG2-HBx及Hep3B-HBx細胞中SATB1的表達隨著 HBx表達的增加而顯著增高(△CT:7.59±0.05 vs9.86±0.02;7.79±0.06 vs10.39±0.02;**p<0.01),細胞失巢凋亡減少(21.8

10、6±1.79％ vs34.12±1.32％;19.87±1.98％ vs35.07±1.56％;**p<0.01),軟瓊脂單克隆形成增多(22.32±1.82％ vs2.24±0.95％;26.57±1.94％ vs5.04±0.99％;**p<0.01)。然后用SATB1-siRNA1轉染 HepG2-HBx細胞,檢測結果顯示在 HBx高表的HepG2-HBx細胞中,SATB1表達受抑制后細胞抵抗失巢凋亡的能力也顯著降低,細胞凋亡率增

11、高(35.34±1.59％ vs23.37±2.05％;**p<0.01),細胞軟瓊脂單克隆形成減少(6.27±1.11％ vs23.18±1.83％;**p<0.01)。用PI-3K、JNK、ERK1/2和P38 MAPK信號分子的抑制劑分別處理HepG2-HBx細胞24h后,與僅用DMSO處理的HepG2-HBx細胞相比,ERKs和P38 MAPK信號分子抑制劑顯著抑制了SATB1的表達(△CT:9.92±0.03 vs7.59±0

12、.06;10.17±0.04 vs7.59±0.06;**p<0.01)及細胞抵抗失巢凋亡的能力,細胞失巢凋亡率增加(36.80±1.61％vs25.21±1.54％;38.51±2.19％ vs25.21±1.54％;**p<0.01),細胞克隆形成率降低(8.32±1.05％ vs22.45±2.26％;6.36±1.37％ vs22.45±2.26％;**p<0.01)。各組細胞中caspase-3, caspase-8和casp

13、ase-9的活化程度檢測結果顯示,隨著 HBx及SATB1表達的增高,caspase-8及caspase-3的活化顯著下降(**p<0.01),而各組細胞中的caspase9均有活化但與 HBx及SATB1的表達水平無顯著相關。接著我們又檢測了上述各組細胞中caspase-8的上游激活因子 FADD的表達情況,發(fā)現(xiàn) FADD的表達水平與 SATB1的表達相反,SATB1負向調控 FADD(△CT:9.02±0.02 vs6.84±0.0

14、3;6.88±0.03 vs8.41±0.06;**p﹤0.01)。并且,FADD在 HepG2-HBx中的表達低于 HepG2肝癌細胞(△CT:7.75±0.03 vs6.31±0.05;**p﹤0.01),而在 HepG2-HBx-SATB1 siRNA1細胞中的表達卻高于 HepG2-HBx細胞(△CT:5.77±0.04 vs7.69±0.02;**p﹤0.01)。
　　結論：我們的研究證實,HBV能誘導肝癌細胞中SATB

15、1的表達及抑制脫落肝癌細胞的失巢凋亡;在HBV編碼的七個蛋白(HBp、HBx、HBs、preS2、preS1、HBc及HBe)中,HBV主要通過HBx激活ERK及p38 MAPK信號通路誘導SATB1的表達,并通過SATB1抑制Fas相關死亡結構域蛋白(FADD)的表達及caspase-8和caspase-3的活化,進而誘導肝癌細胞的失巢凋亡抵抗。此項研究闡明了HBV編碼蛋白HBx誘導SATB1表達和抑制失巢凋亡的作用及分子機制,為HB