HBV X蛋白抑制阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡及可能機(jī)制.pdf

1、研究背景: 全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染者已超過3.5億人，并呈上升趨勢，主要分布在亞洲和非洲，每年大約有一百萬人死于HBV相關(guān)的肝臟腫瘤。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，占癌癥死亡率第二位，嚴(yán)重威脅著人們的健康。HBV感染是引起肝癌的主要原因之一，流行病學(xué)調(diào)查表明，HBV感染者發(fā)生HCC的幾率較正常人高100倍，但HBV致

2、癌的具體機(jī)制尚不明確。 乙型肝炎病毒X基因編碼的X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是一種多功能病毒調(diào)節(jié)蛋白，具有廣泛的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，并能與宿主細(xì)胞的多種蛋白質(zhì)相互作用，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)與細(xì)胞蛋白質(zhì)功能，進(jìn)而影響病毒自身的復(fù)制、宿主細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡等重要過程，HBx的這些功能可能在HBV相關(guān)性HCC的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但其發(fā)揮作用的確切機(jī)制目前尚不清楚，有待于

3、進(jìn)一步研究闡明。 細(xì)胞凋亡(apoptosis)是由特定基因調(diào)控的程序性死亡，對維持機(jī)體的自身穩(wěn)定性和防止惡性腫瘤的發(fā)生是十分重要的。細(xì)胞凋亡的紊亂與多種疾病與腫瘤包括HCC的發(fā)生密切相關(guān)。阿霉素(adriamycin，Adr)是一種臨床上常用的抗腫瘤藥物，它的主要作用機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA損傷和干擾DNA代謝，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。阿霉素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過程可能是通過p53-PTEN通路發(fā)揮作用的。 研究目的:

4、 以阿霉素誘導(dǎo)HepG<,2>細(xì)胞凋亡作為模型，研究HBx對肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及其可能機(jī)制，進(jìn)而為闡明HBx在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法: 以adr亞型HBV質(zhì)粒pHBV DNA為模板，采用PCR法擴(kuò)增HBV X基因片段，并定向插入綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP．C1的HindIII和Kpn I酶切位點(diǎn)，并用HindⅢ、Kpn Ⅰ雙酶切及測序鑒定以構(gòu)建重組體pGFP/HBx。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

5、法將GFP真核表達(dá)載體pEGFP-C1、重組體pGFP-HBx轉(zhuǎn)染HepG<,2>細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后36小時(shí)傳細(xì)胞，用G418篩選出抗性細(xì)胞克隆，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察GFP-HBx融合蛋白表達(dá)，采用RT-PCR檢測HBV X基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，以建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系HepG<,2>/GFP、HepG<,2>/GFP-HBx細(xì)胞。采用阿霉素(2.0ug/ml)分別處理HepG<,2>、HepG<,2>/GFP、HepG<,2>/GFP-H

6、Bx細(xì)胞，阿霉素處理后不同時(shí)間在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化、臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)死亡細(xì)胞。阿霉素處理后36小時(shí)，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率，并采用RT-PCR檢測p53、PTEN的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，采用western blot檢測p53、PTEN蛋白的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 經(jīng)雙酶切及測序鑒定成功構(gòu)建了GFP與HBV X重組表達(dá)載體pGFP-HBx；將pEGFP-C1、pGFP-HBx重組體轉(zhuǎn)染HepG<,2>，經(jīng)G418篩選獲得抗性

7、細(xì)胞克??；在熒光顯微鏡下見部分抗性克隆細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)的GFP熒光蛋白。將帶綠色熒光的抗性克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并經(jīng)傳70代，細(xì)胞仍表達(dá)強(qiáng)的熒光蛋白，RT-PCR檢測表明轉(zhuǎn)染重組體GFP-HBx的HepG<,2>/GFP-HBx細(xì)胞有HBV X基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。在HepG<,2>、HepG<,2>/GFP細(xì)胞，阿霉素誘導(dǎo)了明顯的凋亡性細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、脫落，而在HepG<,2>/GFP-HBx細(xì)胞，未見明顯細(xì)胞死亡;流式細(xì)胞儀分析阿霉素處理

8、后36小時(shí)HepG<,2>、HepG<,2>/GFP、HepG<,2>/GFP-HBx細(xì)胞的凋亡率分別為59.03﹪，61.38﹪，4.21﹪。阿霉素處理后36小時(shí)，RT-PCR和western blot分析發(fā)現(xiàn)，與HepG<,2>、HepG<,2>/GFP細(xì)胞相比，HepG<,2>/GFP-HBx細(xì)胞的PTEN的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)降低，而p53的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平無明顯變化。 結(jié)論: 1、成功構(gòu)建了GFP-HBV X基因的