HBx蛋白激活Snaill表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞上皮間葉樣表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文HBx蛋白激活Snaill表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞上皮間葉樣表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究姓名：盧倩申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)（普外）指導(dǎo)教師：董家鴻20081101第二軍醫(yī)人學(xué)博士學(xué)位論文癌細(xì)胞株HepG2，誘導(dǎo)外源性Snaill蛋白過表達(dá)，觀察Snaill蛋白對肝癌細(xì)胞株上皮表型及侵襲運(yùn)動能力的影響。三、利用我所改建并保存的且鼢基因重組腺病毒表達(dá)載體Ad舢x感染無HBV感染背景的肝癌細(xì)胞株HepG2。觀察外源性H戤基因的介入

2、是否能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株內(nèi)源性Snaill蛋白表達(dá)增高，及其對肝癌細(xì)胞上皮表型及侵襲運(yùn)動能力的影響。四、利用RNAi技術(shù)沉默肝癌細(xì)胞株內(nèi)源性醐mⅣ轉(zhuǎn)錄表達(dá)，觀察內(nèi)源性snaill表達(dá)缺失是否能逆轉(zhuǎn)HBx對肝癌細(xì)胞株EMT的誘導(dǎo)。為此，首先設(shè)計(jì)并篩選出有效的RNA干擾序列，并委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成pGPU6／GFP／Neosh趴，A，』。為了獲得高效的轉(zhuǎn)染效率以保證sh趴，A，J導(dǎo)入HepG2細(xì)胞，將pGPU6／GFP／Neosh肼

3、咐，J『質(zhì)粒改造為重組腺病毒載體Ad—sh卯m，』。Ad—sh甜m，J『和Ad日舭共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞株，觀察細(xì)胞表型及侵襲運(yùn)動能力的改變。五、構(gòu)建5’端裁剪的SⅣA，J『系列啟動子pGL3Basic報(bào)告基因質(zhì)粒。以海。腎熒光素酶質(zhì)粒(pRLTKVector)為內(nèi)參質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株sMMC一772l。比照在共轉(zhuǎn)染空腺病毒載體和Ad—H戤條件下，各啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性，確定HBx蛋白是否能激活SⅣA，J轉(zhuǎn)錄活性，并初步明確其調(diào)節(jié)區(qū)段?！?/p>

4、結(jié)果】一、74例肝癌組織標(biāo)本中，58例HBx表達(dá)陽性，47例Snaill蛋白表達(dá)陽性。45例同時(shí)表達(dá)HBx、Snaill，兩者表達(dá)顯著相關(guān)，p=0002。HBx表達(dá)陽性與E—cadherin表達(dá)缺失、N—cadherin表達(dá)增強(qiáng)相關(guān)，Snaill表達(dá)陽性與E—cadherin表達(dá)缺失、N—cadherin、Vjmentin表達(dá)增強(qiáng)相關(guān)。結(jié)合臨床病理特點(diǎn)分析提示：HBx表達(dá)陽性與HCCTNM分期、腫瘤大小、門靜脈侵犯顯著相關(guān)，Snaill

5、表達(dá)陽性與HcCTNM分期，腫瘤大小、門靜脈侵犯、肝周侵犯和外周血HBVDNA活躍復(fù)制相關(guān)。提示：snaill可作為肝細(xì)胞癌具有較強(qiáng)侵襲轉(zhuǎn)移能力的分子標(biāo)志，snaill的表達(dá)增高極有可能與HBV感染有關(guān)。二、成功構(gòu)建印m朋重組腺病毒載體Ad一卯m，』。Ad鄹艙，能高效感染HepG2細(xì)胞，酣m，J『mRNA和Snaill蛋白表達(dá)顯著上升。HepG2細(xì)胞外源性Snai兒蛋白的過表達(dá)，造成Ecadherin表達(dá)缺失，N—cadhrein、Ⅵm