原花青素B1通過TLR4-MD2抑制LPS介導的炎癥反應.pdf

1、目的:脂多糖為革蘭氏陰性細菌最主要的致病物質(zhì)，又稱內(nèi)毒素，其誘發(fā)的一系列機體炎癥細胞參與的炎性介質(zhì)釋放鏈級炎癥反應，對人體組織造成損傷，甚至引發(fā)膿毒癥導致全身多器官功能不全，危機生命。固有免疫細胞通過Toll樣受體(TLRs)對內(nèi)毒素進行識別，比如單核細胞、巨噬細胞等表面的TLR4在結(jié)合LPS以后即被激活，通過一系列胞內(nèi)信號傳導，釋放出以腫瘤壞死因子α(TNF-α)為代表的前炎癥因子。TLR4與LPS并非直接結(jié)合，與前者同時表達的髓樣分

2、化蛋白2（MD-2）介于兩者之間，而且MD-2內(nèi)部具有LPS的關(guān)鍵毒性成分——脂質(zhì)A的結(jié)合位點。TLR4下游接頭分子是髓樣細胞分化因子88(MyD88)，介導非常重要的MyD88依賴性TLR4信號傳導通路，即包括了NF-κB及MAPK兩條路徑，該通路的激活導致了前炎癥因子釋放，如IL-1β、TNF-α。原花青素(Procyanidin)是一種富含多酚類的化合物，在抗炎免疫方面，其被發(fā)現(xiàn)能夠減低前炎癥因子的分泌。但是原花青素的抗炎機制目前

3、還不完全清楚，有研究顯示在體外細胞炎癥模型中，原花青素對LPS介導的炎癥反應的減輕作用與其對NF-κB及MAPK兩條信號通路的抑制有關(guān)。為了進一步探明原花青素與上游TLR4/MD2復合受體的關(guān)系，本研究以完全表達TLR4的人單核細胞系（THP-1）細胞為模型，觀察原花青素B1對LPS介導的炎癥細胞TLR4/MD2下游關(guān)鍵接頭分子MyD88以及MD-2的轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　方法:人急性單核細胞白血病細胞系THP-1在37℃、5％C

4、O2條件下，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，細胞密度維持在5～10×105個/ml。藥物實驗期間所用細胞均處于對數(shù)生長期。采用CCK-8法測藥物的細胞毒性，將THP-1細胞接種于96孔板中，細胞孵箱預培養(yǎng)，加入不同濃度的原花青素B110μl（終濃度為50～200μg/ml），加入10μL的CCK-8試劑孵育培養(yǎng)后溶液測光吸收值(0D)，并且以得到的安全的原花青素B1濃度范圍進行后續(xù)實驗。采用LPS誘導的THP-1細胞

5、株建立細胞炎癥反應模型，以ELISA法測TNF-α的釋放含量，THP-1細胞接種于96孔板，孵箱預培養(yǎng)24h，之后以LPS(1μg/ml)加或不加原花青素B1(100μg/ml、50μg/ml)刺激THP-1細胞，培養(yǎng)18h，分別收集各組細胞懸液離心后上清液體，與配置好的標準品一起行ELISA檢測，以標準品的光吸收值(0D)建立標準曲線，進而得到各實驗組TNF-α的釋放量水平。沿用LPS誘導的THP-1細胞株建立細胞炎癥反應模型，借助實

6、時定量PCR法分析MyD88mRNA以及MD-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，設(shè)計合成人MyD88的基因序列、人MD-2的基因序列及內(nèi)參人甘油醛脫氫酶GAPDH的基因序列的引物，THP-1細胞接種于6孔板中，孵箱預培養(yǎng)24h，以LPS(1μg/ml)加或不加原花青素B1刺激THP-1細胞，培養(yǎng)18h。提取各實驗組細胞總RNA，之后反轉(zhuǎn)錄成cDNA與引物進行目的基因擴增，計算MyD88mRNA及MD-2mRNA相對定量。
　　結(jié)果:CCK

7、-8測試藥物毒性的實驗中，原花青素B1濃度不大于100μg/ml的情況下THP-1細胞活力幾乎不受影響，而當原花青素B1濃度在150μg/ml200μg/ml的情況下，THP-1細胞活力均受到損害。ELISA檢測TNF-α釋放量實驗中，對于陰性對照組，LPS單獨刺激組的TNF-α分泌水平明顯升高，表明經(jīng)過LPS的刺激，THP-1細胞做出免疫反應，經(jīng)過一系列胞內(nèi)信號傳導，最終釋放出前炎癥因子。原花青素B1干擾組和LPS單獨刺激組相比，其腫

8、瘤壞死因子釋放水平明顯降低，且具有統(tǒng)計學差異。另外，由于原花青素B1干擾的劑量差異，原花青素B1100μg/ml組較原花青素B150μg/ml組所釋放的腫瘤壞死因子α水平更低，且這種差異同樣具有統(tǒng)計學意義。Real-time PCR檢測目的基因的實驗中，和陰性對照組相比，LPS刺激組MyD88mRNA及MD-2mRNA相對量顯著提高，提示LPS可以顯著上調(diào)THP-1細胞的MyD88mRNA及MD-2mRNA表達。而原花青素B1干擾組My

9、D88mRNA及MD-2mRNA相對量較LPS組顯著下降，且差異具有統(tǒng)計學意義，提示原花青素B1對LPS介導的MyD88mRNA及MD-2mRNA表達上調(diào)具有抑制作用。
　　結(jié)論:原花青素B1對于THP-1細胞具有毒性，而當原花青素B1的濃度在100ug/ml及以下時，細胞活力不受損害。原花青素B1可明顯降低LPS誘導下THP-1細胞腫瘤壞死因子α的釋放，并且呈濃度依賴性。原花青素B1這種作用可能其抑制THP-1細胞炎癥反應時My