RSK2通過調(diào)節(jié)STAT2活性介導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞.pdf

1、STAT2是核轉(zhuǎn)錄因子STAT家族成員，JAK/STAT途徑是其活化的經(jīng)典途徑，STAT2通過酪氨酸磷酸化而具有轉(zhuǎn)錄活性。RSK2是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，可磷酸化多種底物，從而在不同刺激下在特定微環(huán)境中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、存活等生物學(xué)效應(yīng)。
　　目的:探討RSK2活化STAT2促進(jìn)單核細(xì)胞分化的機(jī)制。
　　方法:用CheckMateTM Mammalian Two-Hybrid system結(jié)合報(bào)道基因技術(shù)研究R

2、SK2與STAT2的相互作用，根據(jù)RSK2功能域，構(gòu)建RSK2不同缺失片段的真核表達(dá)質(zhì)粒，分別與pCMV-Myc-STAT2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，免疫共沉淀技術(shù)探討RSK2與STAT2結(jié)合及結(jié)合的具體功能域;構(gòu)建Cy1(VH3)-luc報(bào)告質(zhì)粒，與pcDNA4-RSK2和pCMV-Myc-STAT2共轉(zhuǎn)染HEK293，檢測(cè)熒光素酶活性;熒光顯微鏡術(shù)和胞漿胞核分離結(jié)合免疫印跡技術(shù)檢測(cè)PMA刺激下STAT2的核移位;PMA刺激HEK2

3、93細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞裂解液，免疫沉淀技術(shù)結(jié)合免疫印跡技術(shù)檢測(cè)STAT2的絲氨酸-蘇氨酸磷酸化;純化獲得GST-STAT2融合蛋白作為底物，免疫共沉淀獲得活化RSK2作為激酶，進(jìn)行體外激酶實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)STAT2的磷酸化;轉(zhuǎn)染RSK2和STAT2質(zhì)粒于單核細(xì)胞THP-1，PMA刺激后，直接光學(xué)顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞形態(tài)變化、采用XTT實(shí)驗(yàn)間接檢測(cè)細(xì)胞貼壁率。
　　結(jié)果:RSK2通過N-端與STAT2結(jié)合，PMA刺激下RS

4、K2磷酸化STAT2，促進(jìn)STAT2的反式轉(zhuǎn)錄活性和核移位。體外實(shí)驗(yàn)證明STAT2的C-端和N-端存在被RSK2磷酸化的絲氨酸殘基。初步實(shí)驗(yàn)表明活化的RSK2激活STAT2促進(jìn)THP-1分化。
　　結(jié)論:PMA刺激活化MAPK/ERK1/2/RSK2途徑，活化的RSK2使STAT2發(fā)生絲氨酸/蘇氨酸磷酸化并移位入核，發(fā)揮反式轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促進(jìn)THP-1單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。我們的研究為通過對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究闡明細(xì)胞生物學(xué)行為分