ZIP2基因過表達(dá)對人單核細(xì)胞體系THP-1的影響及肺結(jié)核外周血單個核細(xì)胞中ZIP2的初步研究.pdf

1、研究背景:
　　 鋅是生命有機(jī)體維持正常生命活動所必需的微量營養(yǎng)元素之一，它作為多種金屬酶和蛋白的關(guān)鍵組分或輔助因子而廣泛參與生命體中許多種重要的生物化學(xué)反應(yīng)，在機(jī)體的生長、發(fā)育以及代謝過程中發(fā)揮重要作用。哺乳動物中，兩大鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體基因家族參與鋅在細(xì)胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)運(yùn):ZIP和ZnT。ZIP家族蛋白能夠通過增加對胞外的鋅攝取或者促進(jìn)細(xì)胞器內(nèi)的鋅釋放至胞漿，而提高細(xì)胞漿內(nèi)的鋅含量;ZnT家族蛋白則是通過增加細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鋅外流至胞外以及促進(jìn)胞

2、漿內(nèi)的鋅進(jìn)入細(xì)胞器內(nèi)區(qū)室化，而降低細(xì)胞漿內(nèi)的鋅含量。由于兩大鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體基因家族在鋅轉(zhuǎn)運(yùn)功能方面表現(xiàn)出相反的作用，因此鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體在維持細(xì)胞內(nèi)外鋅的平衡穩(wěn)定起著至關(guān)重要作用。
　　 缺鋅會引起生物體免疫功能低下，同時(shí)，缺鋅對鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)會產(chǎn)生重要影響。對小鼠鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)分析研究表明，在一些不成熟的免疫細(xì)胞中ZIP2活躍表達(dá);幼兒過敏性哮喘患者血清鋅明顯低于正常水平，且外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中ZIP2mRNA量顯著高于正常水平

3、。提示在免疫細(xì)胞中ZIP2可能發(fā)揮一定的作用。肺結(jié)核是由結(jié)核桿菌引起的慢性傳染病，在機(jī)體抵抗力低下時(shí)患上肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)會增加。因此，探討單核細(xì)胞中ZIP2過表達(dá)對其產(chǎn)生的影響以及研究ZIP2在肺結(jié)核患者中表達(dá)及其對免疫細(xì)胞因子表達(dá)產(chǎn)生的影響很有必要，為進(jìn)一步研究ZIP2在免疫細(xì)胞功能方面的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 研究目的:
　　 將構(gòu)建的ZIP2真核表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染至人單核細(xì)胞系THP-1中，檢測ZIP2過表達(dá)情況，并檢測Z

4、IP2過表達(dá)對THP-1細(xì)胞中其他鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)、干擾素γ(INF-γ)和白介素6(IL-6)mRNA水平、腫瘤壞死因子α（TNF-α）分泌以及細(xì)胞增殖能力的影響;對比肺結(jié)核患者及正常人PBMC中ZIP2表達(dá)情況，初步探討肺結(jié)核中鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)改變情況，并利用siRNA技術(shù)干擾肺結(jié)核患者PBMC中ZIP2基因表達(dá)，檢測ZIP2干擾對INF-γ和IL-6表達(dá)的影響。
　　 研究方法:
　　 分離正常人的PBMC，Trizol法

5、提取總RNA，通過RT-PCR的方法獲得ZIP2的cDNA后，將其定向克隆至pEGFP-N1真核表達(dá)載體。將構(gòu)建完成的pEGFP-N1-ZIP2真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至人單核細(xì)胞系THP-1。轉(zhuǎn)染48h后，Trizol法抽提轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA，RT-PCR的方法檢測其中ZIP2的過表達(dá)對鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體ZIP1、ZnT1、ZnT5、ZIP6、ZIP8、ZIP10及INF-γ及IL-6mRNA水平產(chǎn)生的影響;采用雙抗體夾心法ELISA測定轉(zhuǎn)染后LPS激

6、活時(shí)TNF-α的分泌情況;通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測ZIP2對細(xì)胞增殖的影響。
　　 臨床收集23例肺結(jié)核患者以及42例正常人的抗凝外周血液樣本并收取相關(guān)臨床資料，同時(shí)收集血清并測定血清鋅含量。分離抗凝血的PBMC，Trizol法提取其中總RNA，通過Real-timePCR的方法檢測PBMC中ZIP2mRNA變化，同時(shí)利用RT-PCR方法檢測分析其中ZnT1、ZIP6、ZIP1、ZnT5、ZIP10表達(dá)情況;利用電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)將siR

7、NA片段轉(zhuǎn)染至肺結(jié)核患者PBMC中，干擾ZIP2表達(dá)，并利用Real-timePCR檢測細(xì)胞因子INF-γ及IL-6表達(dá)改變情況。
　　 結(jié)果:
　　 構(gòu)建的pEGFP-N1-ZIP2真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至THP-1細(xì)胞后，結(jié)果表明THP-1細(xì)胞中ZIP2過表達(dá)，但ZIP2過表達(dá)對ZnT1、ZIP1、ZIP6、ZIP8、ZIP10、ZnT5mRNA量均沒有顯著影響（P＞0.05）;ZIP2過表達(dá)使THP-1細(xì)胞INF-γ表達(dá)

8、下調(diào)(P＜0.05)，而IL-6表達(dá)改變沒有顯著差異（P＞0.05）。ZIP2過表達(dá)對THP-1細(xì)胞分泌的TNF-α和THP-1細(xì)胞的增殖能力均沒有顯著影響（P＞0.05）。
　　 肺結(jié)核患者的血清鋅含量明顯低于正常對照組（P＜0.05）;Real-timePCR結(jié)果顯示肺結(jié)核患者PBMC中ZIP2的表達(dá)量明顯高于正常對照組(P＜0.003)。RT-PCR結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者中，ZnT1表達(dá)上調(diào)(P＜0.00002);ZIP6表

9、達(dá)下調(diào)(P＜1.5×10-9);ZIP1、ZnT5表達(dá)改變沒有顯著差異(P＞0.05);ZIP10表達(dá)下調(diào)（P＜0.003）。利用電穿孔轉(zhuǎn)染siRNA干擾片段干擾肺結(jié)核患者PBMC中ZIP2，Real-timePCR結(jié)果顯示，ZIP2干擾效果明顯，并且ZIP2干擾后肺結(jié)核患者PBMC中INF-γ表達(dá)下調(diào)(P＜0.01)、IL-6表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了pEGFP-N1-ZIP2真核表達(dá)

10、載體，并將其轉(zhuǎn)染至THP-1細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，ZIP2過表達(dá)對THP-1細(xì)胞系中其他鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)、IL-6表達(dá)、細(xì)胞分泌TNF-α、細(xì)胞增殖能力沒有顯著影響，但能使INF-γ表達(dá)下調(diào)。
　　 肺結(jié)核患者PBMC中ZIP2表達(dá)明顯上調(diào)，ZnT1表達(dá)明顯上調(diào)，ZIP6、ZIP10表達(dá)明顯下調(diào)，ZIP1、ZnT5表達(dá)沒有顯著改變;干擾肺結(jié)核患者PBMC中ZIP2表達(dá)后，INF-γ表達(dá)下調(diào)，IL-6表達(dá)上調(diào)。ZIP2對肺結(jié)核患者淋巴