支原體MALP-2通過誘導(dǎo)人單核細(xì)胞產(chǎn)生HO-1負(fù)調(diào)控COX-2的表達(dá).pdf

1、目的：支原體感染所誘導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)是引起組織損傷的重要因素。在支原體感染的同時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)可能具備相應(yīng)的自我防御機(jī)制以對(duì)抗感染所引起的炎癥失控。本研究旨在探討支原體巨噬細(xì)胞活化脂肽2（macrophage-activating lipopeptide-2， MALP-2）能否誘導(dǎo)人單核細(xì)胞系 THP-1產(chǎn)生血紅素氧合酶-1（Hemeoxygenase， HO-1），并探討其是否參與負(fù)調(diào)控環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2，

2、COX-2）的表達(dá)。
　　方法：體外培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，用不同濃度（0、0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、1.0 ng/mL和5.0ng/mL）的MALP-2作用16h，或5.0ng/mL MALP-2作用不同時(shí)間（0h、4h、8h、12 h、16h、24h），Realtime-PCR和Western blot分別檢測(cè)HO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，比色法分析HO-1酶活性改變情況；同時(shí)用不同濃度放線菌素D（actinom

3、ycin D，ActD，0.1～10μM）和放線菌酮（cycloheximide，CHX，0.1～10μM）預(yù)處理THP-1細(xì)胞1h，隨后加入5.0 ng/mL MALP-2刺激16h，Western blot檢測(cè)HO-1的表達(dá)，以證實(shí)HO-1的表達(dá)是否通過轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達(dá)；采用30μM SB203580、PD98059和SP600125預(yù)處理THP-1細(xì)胞30 min后加入5.0 ng/mL MALP-2共孵育細(xì)胞16h，Weste

4、rn blot檢測(cè)HO-1的蛋白表達(dá)情況，以探討HO-1的表達(dá)是否受p38，ERK1/2和JNK的調(diào)控；提取MALP-2處理后的核蛋白及胞漿蛋白，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（NF-E2-related factor2，Nrf2）在細(xì)胞核及胞漿中的表達(dá)情況，并采用 siRNA干擾Nrf2表達(dá)，探討HO-1表達(dá)是否受Nrf2調(diào)控；同時(shí)觀察MALP-2處理前后THP-1細(xì)胞COX-2表達(dá)情況，并采用siRNA干擾

5、HO-1表達(dá)后，Western blot檢測(cè)COX-2蛋白的改變情況，以證實(shí)HO-1能否調(diào)控MALP-2誘導(dǎo)COX-2的產(chǎn)生。
　　結(jié)果：
　　(1)濃度為0、0.01、0.1、1.0、5.0 ng/ml的MALP-2誘導(dǎo)人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)呈濃度依賴性增加。此外，濃度為0、0.01、0.1、1.0、5.0 ng/ml的MALP-2誘導(dǎo)的HO-1酶活性分別為（0.424±0.022） nmo

6、l/mg/h、（0.563±0.133）nmol/mg/h、（1.058±0.189）nmol/mg/h、（1.121±0.148）nmol/mg/h、（1.299±0.186）nmol/mg/h；
　　(2)30μM MAPKs特異性抑制劑SB203580、PD98059和SP600125預(yù)處理THP-1細(xì)胞后，加MALP-2處理16 h后，與單獨(dú)MALP-2組比較，HO-1的表達(dá)量分別抑制了38％、44%和56%，p<0.01

7、，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　(3)5.0 ng/mL MALP-2能降低細(xì)胞漿內(nèi)Nrf2的表達(dá)水平，同時(shí)增加其細(xì)胞核內(nèi)含量；且轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA后，HO-1的表達(dá)下降了40%；
　　(4) MALP-2能以時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)COX-2表達(dá)，且轉(zhuǎn)染HO-1 siRNA后， COX-2的表達(dá)增高了2.6倍。
　　結(jié)論：
　　(1) MALP-2誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞HO-1表達(dá)與MAPKs和Nrf2途徑有關(guān)；