鉛誘導神經膠質細胞炎性因子COX-2表達的分子機制研究.pdf

1、目的:
　　1.用蛋白免疫印跡研究鉛暴露條件下，幾種常用的腦細胞系炎性因子環(huán)氧化酶
　　2(COX-2)的變化情況。
　　2.闡明鉛誘導膠質細胞COX-2表達的分子機制。
　　3.揭示鉛誘導膠質細胞COX-2表達介導的生物學功能，為指導臨床鉛對神經系統損傷等相關疾病用藥提供理論依據。
　　方法:
　　1.對BV-2、C6、PC12和RBE4細胞株進行不同濃度及不同時間的醋酸鉛處理，采用Western

2、blot（蛋白免疫印跡）來檢測細胞內蛋白的表達變化。
　　2.提取細胞的總RNA并逆轉錄，進行PCR檢測cox-2信使RNA的表達變化情況。
　　3.向C6細胞轉染cox-2啟動子報告基因（cox-2 promoter luciferse），得到穩(wěn)定轉染細胞株后，用醋酸鉛刺激該細胞，并檢測其熒光素酶值的變化情況，來反映cox-2啟動子的活性。
　　4.向C6細胞轉染帶有熒光素酶的轉錄因子質粒(NFAT lucifers

3、e、NFκ Bluciferse、AP-1 luciferse)，并得到穩(wěn)定轉染的細胞株。用醋酸鉛對穩(wěn)定轉染的細胞株進行不同濃度和不同時間的刺激，采用熒光素酶報告系統檢測相對應的轉錄因子的活性變化情況。
　　5.向C6細胞轉染導致NFAT功能突變的質粒（cox-2 luxciferse NFAT mut），以確定在NFAT功能受抑制后在不同時間及不同濃度鉛處理之下，相對應的熒光素酶活性變化情況，以檢測NFAT在鉛誘導cox-2轉錄

4、活性過程中所起的作用。
　　結果:
　　1.用不同濃度劑量依賴及不同時間依賴的鉛刺激BV-2、C6、PC12和RBE4細胞株，發(fā)現COX-2在膠質細胞BV-2和膠質瘤細胞C6中表達升高，但在RBE4和類神經元細胞PC12中表達并不明顯。
　　2.PCR的結果表明:25μM的鉛處理24小時即可使BV-2和C6細胞cox-2信使RNA有明顯的誘導表達，且隨著鉛刺激濃度增加cox-2信使RNA表達增加;在不同時間點用50μM

5、的鉛分別刺激BV-2和C6細胞，發(fā)現隨著鉛刺激的時間增加，cox-2信使RNA表達較陰性對照有明顯增加，并且呈依次增加的趨勢。
　　3.向C6細胞轉染cox-2啟動子報告基因，并對穩(wěn)定轉染的細胞株進行鉛刺激。結果顯示，40μM鉛處理12小時后cox-2啟動子轉錄活性較陰性對照增加1.48±0.08倍，24小時為1.72±0.13，。說明鉛可以增加cox-2啟動子的活性，從而增強cox-2的轉錄。
　　4.用蛋白免疫印跡的方法

6、和熒光素酶報告分析系統檢測了部分與cox-2相關的轉錄因子，發(fā)現鉛誘導膠質細胞cox-2基因的表達是依賴NFAT轉錄因子的。隨后對NFAT進行功能性突變，發(fā)現抑制NFAT活性后，cox-2啟動子的活性明顯下降。
　　結論:
　　本課題通過鉛來刺激不同的腦細胞系，蛋白免疫印跡的結果顯示鉛可以誘導神經膠質細胞炎癥因子COX-2表達;在隨后進一步的研究中，我們發(fā)現鉛可以使膠質細胞的cox-2信使RNA表達水平也升高;更進一步的研究