炎性因子OSM誘導(dǎo)乳腺癌惡性演進(jìn)的分子機(jī)制研究.pdf

1、炎癥在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用,被稱為“腫瘤的第七大特征”。炎性微環(huán)境中發(fā)生的一系列生物化學(xué)反應(yīng)推動(dòng)腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化,上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過程中的重要事件。在EMT轉(zhuǎn)化過程中,上皮細(xì)胞極性喪失,細(xì)胞-細(xì)胞及細(xì)胞-基質(zhì)間的粘附減弱,上皮細(xì)胞的標(biāo)志分子E-cadherin下調(diào),間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志分子Vimentin、Fibronectin及EMT的關(guān)鍵調(diào)

2、控分子ZEB1、Snail、Twist等表達(dá)上調(diào)。同時(shí),一系列促轉(zhuǎn)移、促侵襲相關(guān)基因被誘導(dǎo),使腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力增強(qiáng)。
　　炎性微環(huán)境中存在大量的炎性因子,已知炎性因子TNF-α、TGF-β、IL-6等參與了EMT過程。抑瘤素(OncostatinM,OSM)是IL-6家族的重要成員。前期研究提示,在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在的OSM可能與EMT發(fā)生相關(guān)。在本研究中,我們通過對(duì)乳腺癌組織芯片(n=75)的免疫組化分析,觀察到約8

3、0％的乳腺癌組織高表達(dá)OSM,而乳腺良性疾病及正常乳腺組織中OSM的表達(dá)常呈陰性。OSM在乳腺癌組織中以自分泌和旁分泌的形式表達(dá),特別在乳腺癌侵襲前緣,OSM表達(dá)呈強(qiáng)陽性,提示OSM可能參與乳腺癌的轉(zhuǎn)移調(diào)控。此外,對(duì)7種人乳腺癌細(xì)胞系的分析亦證實(shí),具有高侵襲能力的MDA-231和MDA-435S細(xì)胞表達(dá)較高水平的OSM。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,OSM刺激可誘導(dǎo)上皮型的MCF-7和T47D乳腺癌細(xì)胞向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化,E-cadherin下調(diào),V

4、imentin、Fibronectin以及ZEB1、Snail表達(dá)上調(diào),細(xì)胞的遷移、侵襲能力顯著增強(qiáng),表明OSM是一個(gè)強(qiáng)有力的EMT誘導(dǎo)因子。
　　miRNA在EMT過程中執(zhí)行重要的功能,其中l(wèi)et-7及miR-200家族成員在EMT中的作用最受關(guān)注。在Src誘導(dǎo)的MCF-10A細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中,let-7參與NF-κB介導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控,miR-200可直接抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制子(ZEB1和ZEB2)的表達(dá),ZEB

5、1/miR-200正反饋調(diào)控環(huán)路在EMT中發(fā)揮重要的作用。我們的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),OSM可誘導(dǎo)let-7及miR-200表達(dá)下調(diào),但二者呈現(xiàn)獨(dú)特的變化特征,即let-7表現(xiàn)為瞬時(shí)下調(diào),而miR-200的下調(diào)則較為滯后而持久。外源性過表達(dá)let-7或miR-200mimics,可逆轉(zhuǎn)OSM誘導(dǎo)的EMT發(fā)生,使E-cadherin表達(dá)得到恢復(fù),并抑制Fibronectin和ZEB1表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞的遷移、侵襲能力降低,提示let-7瞬時(shí)性下調(diào)及

6、miR-200持續(xù)性下調(diào)在OSM誘導(dǎo)的EMT過程中具有重要的意義。
　　OSM主要激活MEK、JAK/Stat、JNK等信號(hào)通路。我們利用MEK通路抑制劑PD98059、JNK通路抑制劑SP600125、JAK/Stat通路抑制劑WP1066預(yù)處理MCF-7細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)這些抑制劑可不同程度地抑制OSM誘導(dǎo)的EMT。已知MEK、JNK、JAK2信號(hào)通路的激活均可導(dǎo)致Stat3活化。我們的研究證實(shí),OSM刺激可誘導(dǎo)Stat3持續(xù)性活化,

7、而敲低Stat3可顯著抑制OSM誘導(dǎo)的EMT,并可逆轉(zhuǎn)OSM對(duì)let-7和miR-200的下調(diào)效應(yīng),而過表達(dá)組成型激活的Stat3C則可明顯下調(diào)let-7和miR-200的表達(dá)。miRNA主要通過與其靶基因的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)結(jié)合而調(diào)控靶基因的表達(dá)。為了進(jìn)一步證實(shí)Stat3對(duì)let-7及miR-200的調(diào)控作用,我們分別構(gòu)建了含let-7和miR-200靶基因HMGA23’UTR及ZEB13’UTR的熒光素酶報(bào)告載體,分別用這些

8、載體與Stat3C表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞。結(jié)果顯示,過表達(dá)Stat3C可明顯增強(qiáng)HMGA23’UTR及ZEB13’UTR的活性,而對(duì)HMGA25’UTR無影響。敲低Stat3或抑制Stat3信號(hào)通路活化均可抑制let-7靶基因HMGA2的表達(dá),進(jìn)一步表明Stat3對(duì)let-7和miR-200的表達(dá)具有特異性的調(diào)控作用,提示Stat3可能是OSM誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵調(diào)控分子,通過調(diào)控miRNA表達(dá)而影響EMT程序。
　　我們發(fā)現(xiàn),

9、與OSM誘導(dǎo)的let-7瞬時(shí)性下調(diào)相呼應(yīng)的是,let-7靶基因HMGA2、c-Myc、Ras均出現(xiàn)瞬時(shí)性表達(dá)增強(qiáng),過表達(dá)let-7mimics能抑制OSM對(duì)HMGA2、c-Myc、Ras的誘導(dǎo)作用。值得注意的是,HMGA2是一個(gè)胚胎早期基因,在胚胎發(fā)育期高表達(dá)于未分化的增殖性細(xì)胞,而在成體組織中不表達(dá);let-7的表達(dá)恰與之相反,在胚胎階段難以檢測到,而在胚胎發(fā)育末期開始上調(diào),提示let-7-HMGA2軸的瞬時(shí)變化在OSM誘導(dǎo)的EMT中

10、可能是一個(gè)始動(dòng)效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn),敲低HMGA2可顯著逆轉(zhuǎn)EMT表型,抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力,并可使OSM誘導(dǎo)的miR-200下調(diào)得到恢復(fù),表明let-7和HMGA2的表達(dá)動(dòng)力學(xué)變化不僅對(duì)于OSM誘導(dǎo)的表觀調(diào)控具有啟動(dòng)作用,而且對(duì)于miR-200的下調(diào)亦產(chǎn)生重要的影響。
　　通過對(duì)let-7轉(zhuǎn)錄本(pri-let-7)及成熟體(mat-let-7)表達(dá)的分析,我們發(fā)現(xiàn)OSM影響了let-7成熟體的表達(dá),提示Stat3激活可能影響le

11、t-7加工成熟。已知RNA結(jié)合蛋白Lin-28A和Lin-28B是let-7家族成員加工成熟的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控分子。我們觀察到,OSM可誘導(dǎo)Lin-28B的瞬時(shí)性表達(dá)增強(qiáng),此表達(dá)變化特征與let-7下調(diào)的動(dòng)力學(xué)變化一致。敲低Lin-28B表達(dá)可顯著削弱OSM誘導(dǎo)的EMT效應(yīng),揭示了Lin-28B-let-7-HMGA2軸的瞬時(shí)激活在OSM誘導(dǎo)的EMT過程中的關(guān)鍵作用。對(duì)Lin-28B啟動(dòng)子序列分析顯示,Lin-28B啟動(dòng)子序列中含有6個(gè)Sta

12、t3的潛在結(jié)合位點(diǎn)。我們通過ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí),外源性及內(nèi)源性Stat3均能與Lin-28B啟動(dòng)子-2405和-369bp區(qū)的Stat3反應(yīng)元件結(jié)合。更為重要的是,在OSM誘導(dǎo)下,內(nèi)源性Stat3與Lin-28B啟動(dòng)子的結(jié)合具有與Lin-28B表達(dá)、let-7下調(diào)及HMGA2上調(diào)相似的時(shí)空特征。以上證據(jù)證明,OSM誘導(dǎo)的Lin-28B一過性表達(dá)增強(qiáng)決定了let-7-HMGA2軸的瞬時(shí)開啟。
　　為了驗(yàn)證OSM是否可在體內(nèi)誘導(dǎo)EMT,

13、我們建立了穩(wěn)定表達(dá)GFP的MCF-7/GFP乳腺癌細(xì)胞移植瘤模型。當(dāng)瘤體可觸及時(shí),進(jìn)行瘤體內(nèi)注射OSM,每周一次,連續(xù)6周。60天后處死動(dòng)物,分離瘤體、肺、肝組織,對(duì)瘤組織稱重,并作H&E染色和抗GFP抗體免疫組化染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn),OSM處理明顯誘導(dǎo)了乳腺癌自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移。對(duì)瘤組織分析結(jié)果顯示,OSM處理組的腫瘤組織中E-cadherin表達(dá)下調(diào),Vimentin和ZEB1表達(dá)上調(diào),Stat3磷酸化水平升高。同時(shí),一系列與轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)的基因

14、(MMP-2、MMP-7、MMP-9、COX-2、CXCR-4)均被誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)瘤組織miRNA分析的結(jié)果顯示,OSM處理組let-7表達(dá)與對(duì)照組似無明顯差別。但是,OSM注射組的瘤組織中miR-200顯著下調(diào)。這些結(jié)果充分表明,OSM在體內(nèi)亦具有促EMT效應(yīng),并提示OSM誘導(dǎo)的miR-200-ZEB1軸在腫瘤惡性表型的維持過程中發(fā)揮重要作用。
　　上述研究結(jié)果證實(shí),OSM誘導(dǎo)的EMT受轉(zhuǎn)錄因子及miRNA共同構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,

15、而Stat3協(xié)調(diào)、控制并決定了Lin-28B-let-7-HMGA2及miR-200-ZEB1軸的動(dòng)力學(xué)變化,開啟并維持乳腺癌EMT過程,賦予乳腺癌細(xì)胞明顯的間質(zhì)樣表型,促進(jìn)乳腺癌的惡性進(jìn)展。我們的研究首次報(bào)道了OSM的體內(nèi)促EMT效應(yīng)及OSM在乳腺癌惡性演進(jìn)中的作用;首次揭示了OSM誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT的“開關(guān)維持”機(jī)制;首次報(bào)道了Stat3對(duì)Lin-28B的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。我們的研究成果為炎性微環(huán)境誘導(dǎo)腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提