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文檔簡介
1、目的:研究來自病毒巨噬細(xì)胞炎性蛋白Ⅱ(vMIP-Ⅱ)N端合成肽NT21MP對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3細(xì)胞增殖、趨化及凋亡的影響;并利用 BiFC技術(shù)研究檢測(cè)NT21MP與CXCR4結(jié)合作用;通過NT21MP對(duì)CXCR4信號(hào)途徑中信號(hào)蛋白活性影響而闡述NT21MP生物學(xué)作用的分子機(jī)制。
方法:⑴四甲基偶氮唑藍(lán)(M TT)法檢測(cè)NT21MP對(duì)SDF-1α誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3細(xì)胞增殖抑制作用;⑵趨化抑制實(shí)驗(yàn)觀察NT21M
2、P對(duì)于SDF-1α誘導(dǎo)的SKBR-3細(xì)胞趨化抑制作用;⑶ Annexin V-FITC和PI雙染色法檢測(cè)NT21MP抑制SDF-1α誘導(dǎo)的SKBR-3細(xì)胞抗凋亡作用;⑷利用基因工程技術(shù)構(gòu)建pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞,熒光倒置顯微鏡觀察NT21MP與CXCR4的結(jié)合;⑸應(yīng)用Western-blot及RT-PCR法檢測(cè)NT21MP作用于SKB R-3后胞內(nèi)信號(hào)
3、轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中AKT、ERK1/2、FAK磷酸化水平及Bcl-2/Bax比值的變化;⑹利用共聚焦纖維鏡檢測(cè)NT21MP對(duì)SDF-1α誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣流的抑制效應(yīng)。
結(jié)果:⑴增殖抑制實(shí)驗(yàn)中,NT21MP(1.0μg/ml)組OD值明顯低于對(duì)照組及空白組(P<0.05);⑵在趨化抑制實(shí)驗(yàn)中,NT21MP(1.0μg/ml)組穿過膜細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05);⑶流式細(xì)胞術(shù)(FCM)證明NT21MP可抑制SD F-1α誘導(dǎo)的SK
4、BR-3抗凋亡作用(P<0.05);⑷重組質(zhì)粒pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP經(jīng)測(cè)序鑒定構(gòu)建成功,共轉(zhuǎn)染后,通過熒光倒置顯微鏡觀察,在激發(fā)光鏡下可看到pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP共轉(zhuǎn)染組有綠色熒光;⑸應(yīng)用Western blotting技術(shù)證實(shí)NT21MP可以下調(diào)SDF-1α誘導(dǎo)的信號(hào)蛋白AKT、ERK1/2及FAK的磷酸化水平,Western-blot
5、ting及RT-PC R技術(shù)證實(shí)NT21MP下調(diào)Bcl2/Bax的比值;⑹共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SDF-1α可誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣流增加,而NT21MP可下調(diào)這一效應(yīng)。
結(jié)論:NT21MP可有效阻滯SDF-1α誘導(dǎo)的SKBR-3細(xì)胞的促增殖、趨化及抗凋亡作用。NT21MP通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合C XCR4,從而阻斷SDF-1/CXCR4生物軸,下調(diào)SDF-1α誘導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)蛋白AKT、ERK1/2及FAK的磷酸化水平,下調(diào)其下游的Bcl-2/Bax比值
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