桑葚花色苷的提取及其抗乳腺癌作用研究.pdf

1、桑葚又稱桑果、桑棗，為桑科落葉喬木桑樹的成熟果穗，味甘性寒，酸甜汁多，是人們常食的水果之一。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為桑葚既可入食，又可入藥，味甘酸，性微寒，入心、肝、腎，為滋補(bǔ)強(qiáng)壯、養(yǎng)心益智佳果?，F(xiàn)代營養(yǎng)醫(yī)學(xué)研究表明，桑葚具有增強(qiáng)免疫功能，促進(jìn)造血細(xì)胞的生長，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，促進(jìn)新陳代謝等作用，具有一定的藥理學(xué)價(jià)值。
　　 桑葚具備藥理活性的基礎(chǔ)在于其獨(dú)特的食物成分，特別是某些生物活性物質(zhì)。研究表明，成熟桑葚含有豐富的花色苷化合物，膳食花

2、色苷是一類廣泛存在于蔬菜、水果等食物中的天然色素，屬植物化學(xué)素中的黃酮類化合物，流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，膳食花色苷化合物具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化等廣泛、優(yōu)良的生物學(xué)效應(yīng)，特別是其抗腫瘤活性以天然、低毒、高效而備受關(guān)注。由此可以推測，桑葚的藥理學(xué)活性可能在于其含有豐富的花色苷化合物，但相關(guān)研究尚未見報(bào)道，因此提取和純化桑葚花色苷化合物，并研究其藥理活性及相關(guān)作用機(jī)制，對于揭示桑葚的藥理活性本質(zhì)及進(jìn)一步開發(fā)利用桑葚資源

3、均具有一定的意義和價(jià)值。
　　 乳腺癌是嚴(yán)重危害婦女健康的常見惡性腫瘤，是引起婦女死亡的常見腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢且趨向年輕化，如何有效防治乳腺癌，特別是通過日常膳食途徑防治乳腺癌，已成為國內(nèi)外營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域一個(gè)重要研究方向。本課題研究了桑葚花色苷的提取和純化工藝，并對提取和純化過程中的各項(xiàng)重要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了桑葚花色苷提取和純化的最佳方案，由此得到較高含量的花色苷提取物；在此基礎(chǔ)上，本課題探討了桑葚花色苷提取物的抗

4、乳腺癌效應(yīng)，通過體外細(xì)胞增殖檢測、凋亡流式分析、線粒體膜電位的激光共聚焦掃描顯微鏡觀察等實(shí)驗(yàn)，以及體內(nèi)乳腺癌裸鼠移植瘤的抑瘤實(shí)驗(yàn)，研究和評價(jià)了桑葚花色苷提取物的體內(nèi)外抗乳腺癌效應(yīng)，并對可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步的探討。本課題對于探討通過膳食途徑防治乳腺癌以及開發(fā)利用桑葚資源均具有一定的科學(xué)意義。
　　 本課題研究結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 1.確定了超聲輔助乙醇萃取法提取桑葚花色苷和大孔樹脂吸附純化的工藝流程。提取工藝：成熟天然

5、桑葚經(jīng)洗滌、打碎、冷凍干燥，得到冷凍桑葚干粉；將桑葚干粉溶于酸化乙醇溶液中，超聲輔助提取，提取液以5000rpm 離心10min，取上清液；離心后提取液進(jìn)行真空抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋蒸除去乙醇，再用石油醚萃取3次除去脂類，最后利用真空抽濾，得到桑葚花色苷粗提物水溶液。將此溶液冷凍于-70°C 冰箱，冷凍2 h后放入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥為提取物干粉。以Amberlite@XAD7HP型大孔吸附樹脂對桑葚花色苷提取物進(jìn)行純化，并對提取和純化

6、過程中的重要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。確定了提取液乙醇濃度為70％和pH值為3.0，料液比為1:20，提取時(shí)間為80min，純化過程中進(jìn)液流速為2.0ml/min，洗脫流速為1.0ml/min。利用以上提取和純化方法及參數(shù)，最終獲得桑葚花色苷提取物其花色苷總含量為（41.8±4.8）％，產(chǎn)品獲得率為（2.6±0.7）％。
　　 2.以前期獲得的桑葚花色苷提取物作用于乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-453和MCF-7，細(xì)胞生長

7、狀態(tài)及形態(tài)觀察可見，100、150和200mg/ml 桑葚花色苷作用可產(chǎn)生顯著影響，表現(xiàn)為三種乳腺癌細(xì)胞的生長密度明顯稀疏，細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)異常，大量細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)缺損，細(xì)胞皺縮變圓，或出現(xiàn)腫脹，或胞質(zhì)凝縮，眾多細(xì)胞與其周邊細(xì)胞分離，貼壁性下降，甚至離開瓶壁漂浮到培養(yǎng)基中，出現(xiàn)大量漂浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片，表明桑葚花色苷提取物作用可顯著影響三種乳腺癌細(xì)胞的生長和形態(tài)。CCK-8 法細(xì)胞增殖活力檢測結(jié)果表明，100、150和200mg/ml 桑

8、葚花色苷提取物作用可使三種乳腺癌細(xì)胞增殖活性顯著降低，且隨作用濃度的增加降低程度增加，顯示出劑量-效應(yīng)關(guān)系，表明桑葚花色苷提取物作用可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，顯示出較強(qiáng)的體外細(xì)胞毒性，具有體外抗乳腺癌效應(yīng)。
　　 3.以50、100和150mg/ml 桑葚花色苷提取物作用三種乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-453和MCF-7細(xì)胞24 h，采用Annexin V/PI 雙染流式細(xì)胞凋亡分析，結(jié)果顯示，三種乳腺癌細(xì)胞凋亡

9、率均升高，顯示出促凋亡效應(yīng)，且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，100和150mg/ml組凋亡率顯著增高，表明桑葚花色苷提取物可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。利用JC-1探針和激光共聚焦掃描顯微鏡檢測線粒體膜電位，結(jié)果顯示，桑葚花色苷提取物作用24 h，可使MDA-MB-453細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降，表現(xiàn)為紅色/綠色熒光的比值降低，表明桑葚花色苷提取物可降低乳腺癌細(xì)胞線粒體膜電位，促發(fā)凋亡發(fā)生。
　　 4.利用BALB/c 裸鼠制造乳

10、腺癌移植瘤動(dòng)物模型，以50、100和200mg/kg/d的桑葚花色苷提取物進(jìn)行膳食干預(yù)，觀察其體內(nèi)抑瘤效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組裸鼠飼養(yǎng)期間生長狀態(tài)良好，至觀察終點(diǎn)時(shí)，各組間動(dòng)物體重?zé)o顯著差異，表明桑葚花色苷提取物膳食處理無明顯毒副作用；移植瘤生長觀察結(jié)果表明，桑葚花色苷提取物膳食干預(yù)組移植瘤生長速度低于對照組，處理28 d后，桑葚花色苷提取物干預(yù)組移植瘤體積和質(zhì)量均低于對照組，且隨作用劑量增加降低程度增大，顯示出劑量-效應(yīng)關(guān)系，100和

11、200mg/kg/d 干預(yù)組與對照組相比具有顯著性差異，表明桑葚花色苷提取物膳食干預(yù)可顯著抑制乳腺癌移植瘤的生長，顯示出較強(qiáng)的體內(nèi)抑瘤效應(yīng)。
　　 綜上所述，本課題提出了桑葚花色苷的提取和純化工藝，并對提取和純化過程中的各項(xiàng)重要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了桑葚花色苷提取和純化的最佳方案；在此基礎(chǔ)上，通過體外細(xì)胞增殖檢測、凋亡流式分析、線粒體膜電位的激光共聚焦掃描顯微鏡觀察等實(shí)驗(yàn)，以及體內(nèi)乳腺癌裸鼠移植瘤的抑瘤實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了桑葚花色苷提取