應(yīng)用蛋白敲除技術(shù)降解ErbB家族的抗乳腺癌作用及其機(jī)制研究.pdf

1、分類(lèi)號(hào)：密級(jí)：學(xué)位類(lèi)別：R7379科學(xué)學(xué)位團(tuán)專(zhuān)業(yè)學(xué)位口學(xué)校代碼：學(xué)號(hào)：學(xué)科門(mén)類(lèi)：100622010601042醫(yī)學(xué)又亨章眚科矢辱博士學(xué)位論文DOCTORALDISSERTATION論文題目：應(yīng)用蛋白敲除技術(shù)降解ErbB家族的抗乳腺癌作用及其機(jī)制研究TITLE：StudyonsimultaneoustargetingoftheentireErbBreceptortyrosinekinasesfordegradationbytheprote

2、inknockoutsysteminbreastCanCer一級(jí)學(xué)科：臨床醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科：腫瘤學(xué)論文作者：孔凡銘指導(dǎo)教師：郝希山教授導(dǎo)師組成員：任秀寶李慧周蓬勃天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二。一三年五月天津醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文中文摘要目的：采用“蛋白敲除”技術(shù)一即調(diào)控SCF泛素一蛋白水解酶的底物特異性，降解乳腺癌細(xì)胞內(nèi)磷酸化的ErbB家族蛋白，在細(xì)胞及動(dòng)物模型中觀察對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、化療敏感性以及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響；探討、研究蛋白敲除技術(shù)降

3、解ErbB家族的抗腫瘤機(jī)制，為開(kāi)發(fā)針對(duì)ErbB家族的新型抗腫瘤靶向藥物提供理論基礎(chǔ)。方法：1、(1)為驗(yàn)證前期所構(gòu)建peDNA30FTrcpShe和pcDNA30F—TrcpShc(F198V)質(zhì)粒的功能，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，免疫共沉淀(Co—IP)法檢測(cè)FTrcp—She泛素連接酶與ErbB蛋白的相互作用；Westernblotting檢測(cè)FTrcp—Shc對(duì)ErbB蛋白的降解作用；將相應(yīng)質(zhì)粒與HisUb共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測(cè)FT

4、rcp—Shc對(duì)ErbB2泛素化作用的影響；(2)將peDNA30FTrcp—Shc和pcDNA30一F—TrcpShe(F198V)質(zhì)粒酶切，亞克隆入pBMNGFP，構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBMN—GFP—F—TrcpShe及pBMNGFPFTrcp—She(m)，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸埃希菌，篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定：(3)將重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒pAmpho共同轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞，包裝獲得攜帶目的基因

5、的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒；(4)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染ErbB過(guò)表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系SKBR3、BT474，流式細(xì)胞儀分選GFP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，Puromycin加壓篩選7天，Westemblot檢測(cè)Flag蛋白表達(dá)。2、(1)WesternbloRing、RealtimePCR檢測(cè)篩選后乳腺癌細(xì)胞系SKBR3及BT474中ErbB家族的蛋白、mRNA表達(dá)情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)ErbB家族膜蛋白表達(dá)情況；(2)Westernblotting檢測(cè)蛋白酶體抑制劑M

6、Gl32、溶酶體抑制劑氯喹對(duì)F—TrCP—ShcE3泛素連接酶誘導(dǎo)ErbB家族蛋白降解的抑制作用；(3)Westernblotting檢測(cè)FTrCPSheE3泛素連接酶降解乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ErbB家族蛋白對(duì)其下游信號(hào)通路活性的影響。3、(1)在細(xì)胞模型中，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、AnnexinV／PI雙染色法、X1vr、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法，觀察蛋白敲除方法降解ErbB家族對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、化療敏感性以及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響；(2)通過(guò)乳腺癌細(xì)胞