染料木黃酮抗乳腺癌作用的表觀遺傳機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是當(dāng)今嚴(yán)重威脅全球女性健康的最常見惡性腫瘤之一。膳食、營養(yǎng)因素在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用。流行病學(xué)研究和系統(tǒng)評價的研究結(jié)果顯示,大豆及其制品的攝入量和乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險呈明顯負(fù)相關(guān)。異黃酮(Isoflavones)是一類多酚類化合物,主要活性成分有大豆苷元(二羥基異黃酮,Daidzein)、染料木黃酮(三羥基異黃酮,Genistein)、生物單寧A(BionhaninA)、芒柄花黃素(Formononetin)等。最近的

2、研究發(fā)現(xiàn)異黃酮具有調(diào)節(jié)宿主免疫功能、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、雌激素與抗雌激素、抗氧化和調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)等廣泛的生物學(xué)作用。
　　異黃酮在乳腺癌預(yù)防方面的研究進(jìn)行了二十多年。起源在于眾多流行病學(xué)的調(diào)查資料發(fā)現(xiàn)亞洲人乳腺癌發(fā)生率顯著低于歐美人,認(rèn)為亞洲人的膳食中含有大量豆類食物,豆類中的主要活性成分異黃酮發(fā)揮了重要作用。異黃酮預(yù)防乳腺癌的機(jī)制主要有:(1)抑制酪氨酸蛋白激酶的活性和表達(dá);(2)改變生長因子的活性,抑制腫瘤細(xì)胞血管新生;(3)抑制

3、酶活性(包括3β-羥基類固醇脫氫酶等);(4)作用于雌激素受體ERα和ERβ。我科室及國外的研究也在異黃酮調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面做了一些報道。但其確切的分子機(jī)制仍未完全闡明。
　　由于癌癥的調(diào)控機(jī)制通常呈網(wǎng)絡(luò)狀,相互作用緊密聯(lián)系,通過調(diào)節(jié)其中一個環(huán)節(jié)往往難以起到顯著作用,迫切需要研究者從新的角度認(rèn)識異黃酮預(yù)防乳腺癌的作用機(jī)制。而最近幾年對表觀遺傳尤其是DNA甲基化的報道,可能為我們的研究提供了一個新的思路。DNA甲基化是在DNA甲

4、基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的作用下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體,將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到基因組DNA胞嘧啶的第5位碳原子上。DNA高甲基化導(dǎo)致的基因抑制和基因組不穩(wěn)定性有關(guān),也能使腫瘤抑制基因受到抑制和染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。在癌細(xì)胞中,正常的未甲基化的CpG島發(fā)生的高甲基化,可能導(dǎo)致重要基因的沉默,例如一些腫瘤抑制因子的活性抑制。同時在其他區(qū)域的CpG二核苷酸可能變成低甲基化,使正常沉默的基因(例如促癌基因或逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子)的轉(zhuǎn)錄抑制降低?；?/p>

5、因的啟動子區(qū)域發(fā)生的甲基化異常是癌變基因表達(dá)異常的重要機(jī)制。一些在乳腺癌中經(jīng)常發(fā)生甲基化變異的基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和總結(jié)。
　　最經(jīng)典的實驗證明異黃酮可以調(diào)節(jié)哺乳動物的表觀基因的是Dolinoy等人為了驗證母鼠的膳食攝入可以影響子代小鼠的表觀基因狀態(tài),采用250mg/kg的染料木黃酮(Genistein)喂食,觀察Agouti基因的變化和該基因引起的表型(小鼠毛色)的變化。Agouti基因表達(dá)較低時,毛發(fā)顏色主要偏向黑色;而Agouti

6、基因表達(dá)較高時,毛發(fā)顏色偏向淺黃色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,喂食GEN的母鼠生出的小鼠IAP啟動子CpG島的甲基化水平升高,Agouti基因的表達(dá)受到抑制,從而使動物毛發(fā)顏色變深,且子代小鼠成年后體型也較瘦。這項表觀遺傳學(xué)上的里程碑式的發(fā)現(xiàn)不僅確認(rèn)了異黃酮作為一種甲基化營養(yǎng)添加劑的重要意義,也表明了環(huán)境因素、孕期膳食、營養(yǎng)補充劑等因素可以通過影響基因的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)而改變基因的表達(dá)與功能,從而影響疾病的表型。
　　基于以上分析,推測

7、GEN可通過調(diào)控DNA甲基化抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。本研究以人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7為研究對象,采用Real-timePCR、MSP等方法,研究了不同濃度和時間的GEN處理下基因組甲基化水平的變化,DNMT表達(dá)的變化以及癌癥相關(guān)基因(ATM、APC、PTEN、MASPIN、14-3-3sigma)的mRNA和啟動子甲基化的變化,以期探討GEN對乳腺癌細(xì)胞株的甲基化程度和基因表達(dá)的影響。
　　主要實驗結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1.細(xì)胞

8、活力檢測結(jié)果顯示,GEN處理24h時細(xì)胞活力沒有明顯變化,GEN處理48h和72h時細(xì)胞活力被顯著抑制(P<0.05),并且100μM的效果比60μM更明顯(P<0.05)。結(jié)果表明60μM和100μM的GEN對乳腺癌細(xì)胞MCF-7活力有明顯抑制作用。
　　2.基因組總體甲基化水平的檢測結(jié)果顯示,GEN處理24h后,60μM和100μM均沒有明顯變化;處理48h后,60μM和100μM使總體甲基化水平明顯降低(P<0.05);處理

9、72h后,100μM組比60μM組的總體甲基化降低明顯(P<0.05)。該結(jié)果提示GEN對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用可能與其降低DNA甲基化水平有關(guān)。
　　3.對DNMT的檢測結(jié)果顯示處理24h后,100μM的GEN明顯抑制DNMT活性,處理48h和72h后,60μM和100μM的GEN均能使DNMT活性明顯降低(P<0.05)。Real-timePCR結(jié)果顯示處理24h后,60μM和100μM的GEN對DNMT1mRNA沒有

10、明顯影響,但處理48h和72h后,60μM和100μM的GEN使DNMT1mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。進(jìn)一步采用分子對接研究發(fā)現(xiàn)GEN能與DNMT1催化甲基化的活性區(qū)域結(jié)合,抑制其發(fā)揮甲基化活性。
　　4.對基因表達(dá)和甲基化程度的檢測結(jié)果顯示,GEN對基因mRNA表達(dá)和DNA甲基化的改變程度各不相同。研究發(fā)現(xiàn)在ATM基因中,60μM和100μM的GEN處理72h使甲基化水平明顯降低。在APC、PTEN和MASPIN基因