抑癌基因IRF8在人乳腺癌中的表觀遺傳調(diào)控及功能機制研究.pdf

1、目的：
　　通過檢測抑癌基因干擾素調(diào)節(jié)因子8（Interferon regulatory factor8，IRF8）在人乳腺癌細胞株中的表達水平以及在人乳腺癌組織中的啟動子甲基化狀態(tài)，分析IRF8啟動子異常甲基化與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性，研究IRF8對人乳腺癌細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、遷移侵襲等生物學行為的影響，驗證IRF8是乳腺癌的抑癌基因，探討IRF8抑癌作用的分子機理，為乳腺癌的早期診斷、預后評估、新藥開發(fā)等奠定基礎

2、。
　　方法：
　　1.采用 real-time PCR檢測 IRF8在6株乳腺癌細胞（BT549、MDA-MB-231、MB468、MCF7、SK-BR-3及T47D）及乳腺上皮細胞 HBL-100中的表達，RT-PCR和 western blot檢測 IRF8在MDA-MB-231，T47D，SK-BR-3及HBL-100中的表達；
　　2.采用甲基化特異性PCR（Methylation-specific PCR，

3、MSP）檢測IRF8在人乳腺癌組織及癌旁組織中的啟動子甲基化狀態(tài)，統(tǒng)計分析IRF8啟動子甲基化與人乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性；
　　3.通過查詢 GOBO數(shù)據(jù)庫（http://co.bmc.lu.se/gobo/），分析乳腺癌不同組織學分級中，IRF8表達與乳腺癌患者無遠處轉(zhuǎn)移生存率（Distance metastasis free survival，DMFS）的關(guān)系；
　　4.在IRF8表達缺失的細胞株中外源性表達IRF8

4、，通過克隆形成實驗檢測IRF8對乳腺癌細胞克隆形成能力的影響；CCK-8實驗評估IRF8對乳腺癌細胞增殖的調(diào)節(jié)作用；劃痕愈合實驗測量IRF8對乳腺癌細胞遷移的作用；Transwell侵襲實驗檢測 IRF8對乳腺癌細胞侵襲能力的調(diào)節(jié)，流式細胞術(shù)量化 IRF8對細胞周期和細胞凋亡的影響；real-time PCR檢測遷移侵襲相關(guān)因子VEGF、MMP2和MMP9以及增殖標記物K i-67表達變化；
　　5. MSP檢測IRF8在MDA-

5、MB231和SK-BR-3細胞中的甲基化狀態(tài)；Real-time PCR驗證IFN-γ對IRF8表達的調(diào)節(jié)作用；流式細胞術(shù)評估乳腺癌細胞中外源性表達 IRF8對 IFN-γ促凋亡作用的影響；western blot檢測 IFN-γ對磷酸化信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子1（phosphorylated signal transducer and activator of transcription1，p-STAT1）的調(diào)節(jié)作用。
　　6.利

6、用real-time PCR檢測IRF8對于JAK/STAT1信號通路關(guān)鍵信號分子JAK1、JAK2和STAT1的調(diào)節(jié)作用；western blot檢測IRF8對p-STAT1的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1. IRF8在6株人乳腺癌細胞中的表達較乳腺上皮細胞HBL-100顯著降低（P＜0.05），IRF8在MDA-MB231和T47D細胞株中表達缺失，SK-BR-3中低表達，HBL-100中高表達；
　　2.114例

7、人乳腺癌組織中，56例出現(xiàn)異常甲基化改變，IRF8在人乳腺癌組織中的異常甲基化率為49.12%（56/114），IRF8在人乳腺癌旁組織中甲基化率為7.69%（1/13），結(jié)合臨床資料，IRF8甲基化與乳腺癌臨床病理特征無相關(guān)性；
　　3.組織學分級為1級和2級的乳腺癌中，IRF8的表達與DMFS無相關(guān)性（P＞0.05），在3級乳腺癌中，IRF8高表達組的DMFS較IRF8低中表達組長，差異具有顯著性(P＜0.05)；
　　

8、4.在MB231和T47D細胞中，IRF8轉(zhuǎn)染組相對克隆形成數(shù)目顯著降低，分別為55.2±6.4、53.6±6.6(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染IRF8的MB231細胞較對照組在48h（0.26±0.007、0.38±0.012），72h（0.36±0.021、0.51±0.021），96h（0.43±0.039、0.61±0.040）生長減慢(P＜0.05)，G0/G1期細胞比例增加(61.08±0.147、63.06±0.225)(P＜0.

9、05)，凋亡細胞比例上升（14.55±0.532、10.73±0.375）(P＜0.05)；MB231細胞中，轉(zhuǎn)染IRF8組劃痕愈合時間減慢，而在T47D細胞中無明顯變化；MB231穿膜細胞數(shù)減少(24.6±2.5、5.3±1.5)(P＜0.05)；其中VEGF、MMP-9和Ki-67的表達顯著下降（P＜0.05），而MMP-2無顯著變化（P＞0.05）；
　　5. IFN-γ處理組和未處理組相比，pcDNA3.1/MB231和p

10、cDNA3.1-IRF8/MB231細胞中 IRF8的表達均無顯著變化（P＞0.05），SK-BR-3細胞中IRF8的表達隨IFN-γ濃度上升而顯著上調(diào)（P＜0.05）；IFN-γ未處理組與處理組之間的凋亡差值在pcDNA3.1-MB231(2.57±0.23) pcDNA3.1-IRF8-MB231和（6.92±0.312）兩組細胞之間具有顯著差異（P＜0.05），伴隨p-STAT1蛋白表達顯著上升；在pcDNA3.1-MB231和p

11、cDNA3.1-IRF8-MB231細胞中，IRF8促進JAK2，STAT1的表達及p-STAT1蛋白表達，具有顯著差異（P＜0.05），而不影響JAK1表達（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. IRF8在人乳腺癌細胞株中表達顯著下調(diào)或缺失，在3級乳腺癌中，高表達IRF8具有較好的DMFS，IRF8可能為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因素；
　　2. IRF8盡管在人乳腺癌組織中出現(xiàn)異常高甲基化，但IRF8啟動子甲基化與乳腺癌臨床病