UBE4B負(fù)性調(diào)控乳腺癌抑癌基因p53的蛋白水平.pdf

1、研究目的:
　　p53是目前哺乳動(dòng)物中最為重要的抑癌基因之一，超過(guò)一半以上的人類癌癥中，p53都存在著突變或者缺失;UBE4B是近年來(lái)最新發(fā)現(xiàn)的E4泛素化因子，有研究證實(shí)，內(nèi)源性UBE4B與p53和Hdm2存在相互作用，且能夠負(fù)性調(diào)控p53的功能和穩(wěn)定性。本文擬對(duì)乳腺癌中的UBE4B是否可以促進(jìn)p53的泛素化和降解，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)腫瘤的形成進(jìn)行研究，以探討UBE4B是否有可能成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。
　　研究方

2、法:
　　收集乳腺癌病例新鮮組織，westernblot觀察乳腺癌組織細(xì)胞及周圍正常乳腺組織細(xì)胞中UBE4B的蛋白水平，以及乳腺癌組織細(xì)胞中UBE4B和p53之間的蛋白水平關(guān)系，本課題使用乳腺癌細(xì)胞系MCF-7及SK-BR-3進(jìn)行了泛素化實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)等，最終證實(shí)在乳腺癌中UBE4B和p53存在著相互作用以及UBE4B可以負(fù)性調(diào)控p53的功能和穩(wěn)定性。
　　研究結(jié)果:
　　一、UBE4B和

3、p53在乳腺癌中的表達(dá)及UBE4B促進(jìn)p53的泛素化水平
　　Westernblot結(jié)果顯示，在乳腺癌組織中，UBE4B的蛋白水平顯著高于乳腺癌周圍正常組織，而且乳腺癌組織中，UBE4B和p53的蛋白水平也基本呈負(fù)相關(guān);在MCF-7細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)UBE4B及Hdm2明顯促進(jìn)了p53的泛素化水平。相反，當(dāng)敲低細(xì)胞中UBE4B的蛋白表達(dá)后，p53的泛素化水平也隨之降低。相似的情況也可以在SK-BR-3細(xì)胞中觀察到。
　　二、UB

4、E4B和Hdm2及p53的體內(nèi)相互作用
　　在MCF-7細(xì)胞中，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UBE4B與p53存在著相互作用;同樣，結(jié)果也顯示UBE4B與Hdm2也存在相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明，在乳腺癌中，UBE4B與Hdm2和p53存在著體內(nèi)相互作用。
　　三、UBE4B負(fù)性調(diào)控p53并且促進(jìn)p53的降解
　　P53-/-的MCF-7細(xì)胞中，共同過(guò)表達(dá)p53、Flag-UBE4B以及Myc-Hdm2，p53的蛋白水平呈

5、現(xiàn)下調(diào)狀態(tài);相反，敲低細(xì)胞中的UBE4B和Hdm2，p53的蛋白水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在表達(dá)野生型p53的MCF-7細(xì)胞中梯度過(guò)表達(dá)UBE4B，p53呈現(xiàn)劑量依賴的下調(diào)的蛋白水平;我們分別將UBE4B-siRNA和con-siRNA轉(zhuǎn)入MCF-7細(xì)胞用以證實(shí)在乳腺癌中，UBE4B對(duì)于Hdm2介導(dǎo)的p53降解是必要的。
　　四、UBE4B抑制依賴于p53的細(xì)胞凋亡并且促進(jìn)腫瘤的形成
　　為了證實(shí)這個(gè)結(jié)論，我們進(jìn)行了細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，當(dāng)

6、過(guò)表達(dá)UBE4B時(shí)，p53的蛋白水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且細(xì)胞凋亡的數(shù)量明顯減少，說(shuō)明UBE4B抑制細(xì)胞凋亡;在共轉(zhuǎn)UBE4B-siRNA及Hdm2-siRNA的細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡的數(shù)量明顯多于共轉(zhuǎn)UBE4B和Hdm2的細(xì)胞。為了進(jìn)一步證實(shí)UBE4B對(duì)體內(nèi)成瘤的效應(yīng)，我們建立了裸鼠成瘤模型，分別給裸鼠皮下注射過(guò)表達(dá)UBE4B和空白載體的MCF-7細(xì)胞，結(jié)果顯示注射過(guò)表達(dá)UBE4B細(xì)胞的一側(cè)腫瘤生長(zhǎng)速度明顯大于注射過(guò)表達(dá)空白載體的一側(cè)。