乳腺癌血漿循環(huán)核酸p53基因突變的意義

1、<p>　　乳腺癌血漿循環(huán)核酸p53基因突變的意義</p><p>　　作者：呂韶敏　汪海丹　斯曉明　張燕軍　張亮　潘伯榮　任軍 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 乳腺腫瘤 </p><p>　　關(guān)鍵詞: 乳腺腫瘤;DNA，血漿;突變，p53基因 </p><p>　　摘 要:目的 探討血漿循環(huán)核酸p53基因突變檢測(cè)的可行性

2、，研究乳腺癌患者循環(huán)核酸p53基因突變對(duì)于乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后估計(jì)的臨床意義. 方法 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增p53基因外顯子5～8，并用變性高效液相色譜技術(shù)（DHPLC）分析產(chǎn)物突變情況，再與各生物學(xué)參數(shù)進(jìn)行了相關(guān)研究. 結(jié)果 33例患者中14例（42.4%）p53基因突變，且突變率與組織分化級(jí)別、ER陰性顯著相關(guān)（P&lt;0.05），與臨床分期和淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況無關(guān). 結(jié)論 DHPLC可作為一種快速簡便的

3、基因突變檢測(cè)手段，p53基因突變?cè)谌橄侔┭h(huán)核酸中有較高的檢出率并預(yù)示腫瘤的惡性程度，血漿基因突變有望成為簡便的預(yù)后參考指標(biāo). </p><p>　　Keywords:breast neoplasms;plasma DNA;p53gene;muta-tion </p><p>　　Abstract:AIM To evaluate the presence of tumor DNA in p

4、lasma and study the clinical significance of p53gene muta-tions associated with the development and prognostic signifi-cance in breast cancer.METHODS Extraction of DNA from patients’plasma and the target DNA fragments we

5、re ampli-fied by PCR.The production were analyzed by denaturing high performance liquid chromatography（DHPLC）.The mu-tation status obtained by DHPLC was confirmed by DNA se┐quencing.RESULTS The total p53gene exon5to exon

6、8muta</p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　p53基因是目前人類腫瘤中最常變化的抑癌基因，大量研究表明p53基因的丟失或突變失活與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其突變點(diǎn)主要集中于第5～8外顯子［1］ .血漿DNA是穩(wěn)定存在于血漿中的DNA片斷，正常人血漿DNA水平很低，難以檢測(cè)到，而惡性腫瘤患者血漿DNA含量顯著增高，超過健康人10～

7、100倍以上.惡性腫瘤患者的血漿DNA多來源于腫瘤原發(fā)灶代謝活躍的或者脫落死亡的腫瘤細(xì)胞，可較穩(wěn)定地存在于血漿中，導(dǎo)致腫瘤患者血漿DNA明顯高于正常人［2］ .本研究采用PCR及DHPLC方法對(duì)33例乳腺癌患者血漿進(jìn)行DNA提取及p53基因外顯子5～8的突變分析，并與測(cè)序結(jié)果對(duì)比，證實(shí)了乳腺癌血漿中可檢測(cè)到p53突變，建立了一種快速、簡易檢測(cè)乳腺癌DNA突變的新方法，為臨床的診斷、預(yù)后提供了較好的腫瘤標(biāo)志. </p>&l

8、t;p><b>　　1 對(duì)象和方法 </b></p><p>　　1.1 對(duì)象 取自2001-06/2002-01在我科住院的33例術(shù)后病理確診的乳腺癌患者，均為女性，年齡在36～67（中位年齡54）歲.浸潤性導(dǎo)管癌29例，單純癌4例.臨床分期:Ⅰ期3例，Ⅱ期11例，Ⅲ期8例，Ⅳ期11例.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性24例，陰性9例.患者空腹時(shí)，用EDTA-K2 抗凝管采集靜脈血2mL，立即300

9、0g離心10min，取血漿于-20℃冰箱保存或即刻提取DNA.PCR使用DNA擴(kuò)增試劑盒（美國Promega公司產(chǎn)品）和PTC-200智能型熱循環(huán)儀（美國MJ Research，Inc產(chǎn)品），引物參照文獻(xiàn)［3，4］設(shè)計(jì)，由TaKaRa公司合成.100bp DNA梯度以及瓊脂糖購自華美生物工程公司，DHPLC為美國Transgenomic公司W(wǎng)AVETMDNA片斷分析系統(tǒng)，色譜柱為其DNA Sep分析柱.PCR產(chǎn)物由上海申友公司純化后使用

10、自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序. </p><p><b>　　1.2 方法 </b></p><p>　　1.2.1 DNA提取和PCR反應(yīng) DNA提取參照試劑盒進(jìn)行.PCR反應(yīng)體系25μL（10×Buffer，2.5μL，2.5mmol L </p><p>　　-1 MgCl2 1μL，250mmol L-1 dNTP1μL，10μmol

11、L-1 引物各1μL，Progema Taq酶1.5U），血漿DNA提取物3μL作為模板DNA，陽性對(duì)照模板1μL.反應(yīng)體系95℃預(yù)變性3min后開始進(jìn)行35個(gè)反應(yīng)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72℃延伸10min，循環(huán)參數(shù)如下:exon5，6（408bp）:94℃變性1min，55℃退火45s，72℃延伸1min;t-Sense為5’-TTCCTCTTCCTGCAGTACTTC-3’t-AntiSense為5’-AGTTGCAAACCAGCCTG

12、AGG-3’.exon7（133bp）:94℃變性45s，59℃退火30s，72℃延伸45s;t-Sense為5’-TCTCCTAGGTTGGCTCT-GAC-3’t-AntiSense為5’-CAAGTGGCTCCT-GACCTGGA-3’.exon8（193bp）:94℃變性45s，56℃退火30s，72℃延伸1min;t-Sense為5’-CGT-CAAGACTT-TTCCTATCCTG-3’t-AntiSense為5’-CGGT

13、CGACCTTCTTGTCCTGC-3’</p><p>　　1.2.2 DHPLC檢測(cè)靶序列突變 參照文獻(xiàn)［5］方法自動(dòng)進(jìn)樣，每份產(chǎn)物進(jìn)樣量為8μL.體系流動(dòng)相為0.1mol L-1 N-三乙基乙酰胺（TEAA，色譜純）和不同濃度的乙腈梯度洗脫（濃度梯度由其軟件系統(tǒng)WAVE Maker4.0根據(jù)核苷酸系列生成，流速為0.9mL min-1 ）;檢測(cè)器為紫外分光光度計(jì)（波長260nm），樣品在最佳變性溫度下按突

14、變方式分析. </p><p>　　1.2.3 DNA測(cè)序 測(cè)序樣品為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各100μL（DNA含量大于200ng），同時(shí)提供引物序列做DNA PCR產(chǎn)物直接測(cè)序分析. </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　在33例乳腺癌患者的循環(huán)核酸中，p53基因熱點(diǎn)區(qū)域第5～8外顯子突變測(cè)定的結(jié)果顯示有14例出現(xiàn)突

15、變，占42.4%（14/33）.7/14為第5，6外顯子的突 變，外顯子7突變3例，外顯子8突變4例.Fig1為血漿DNA p53基因外顯子7擴(kuò)增結(jié)果.Fig2顯示第7外顯子突變的測(cè)定結(jié)果.突變結(jié)果通過Fisher精確檢驗(yàn)表明與組織分化級(jí)別、ER陰性和患者無病生存期顯著相關(guān)（P&lt;0.05）.p53基因突變?cè)冖?Ⅱ期乳腺癌為35.7%（5/14），Ⅲ/Ⅳ期為47.3%（9/19），無顯著性差異（P&gt;0.05），

16、與患者有無淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)關(guān)系（P&gt;0.05）. </p><p>　　圖1 － 圖2 略 </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　p53基因定位于染色體17p13.1，是一重要的抑癌基因，該基因的缺失和突變已被證實(shí)是多種腫瘤的始動(dòng)因素之一，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān).其結(jié)構(gòu)有5個(gè)進(jìn)化上的高度

17、保守區(qū)，多數(shù)p53基因突變是發(fā)生在這些保守區(qū)內(nèi)的5～8外顯子［1，6］ .有大量文獻(xiàn)報(bào)道乳腺癌腫瘤組織中p53突變是一個(gè)經(jīng)常和早期事件，其與病理分級(jí)、早期腫瘤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后生存期及早期復(fù)發(fā)有關(guān)［7］ .Leon等在20世紀(jì)70年代就發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的血漿中存在游離DNA，其濃度與腫瘤分級(jí)和對(duì)治療的反應(yīng)有關(guān)［8］ .研究證實(shí)，乳腺癌患者較健康女性血漿中DNA濃度高得多，在乳腺癌患者中，血漿DNA水平也與組織分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān).同時(shí)發(fā)現(xiàn)

18、血漿中p53突變與臨床分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER地位有重要意義，血漿p53突變的乳腺癌患者的生存期較短，腫瘤惡性程度高［9］ .我們采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法擴(kuò)增p53基因外顯子5～8，再用變性高效液相色譜法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行突變分析，并與測(cè)序結(jié)果比較.經(jīng)DHPLC檢測(cè)有14例發(fā)生突變，與DNA測(cè)序結(jié)果一致.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)p53基因突變率在Ⅰ/Ⅱ期乳腺癌為35.7%（5/14），Ⅲ/Ⅳ期中為47.3%（9</p><p>

19、;<b>　　參考文獻(xiàn): </b></p><p>　　［1］Greenblatt MS，Bennett WP，Hollatein M.Mutation in the p53tumor suppressor gene clues to cancer etiology and molecular　pathogenesis ［J］.Cancer Res，1994;54（18）:4855-4868

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