HS及其體外抗乳腺癌作用.pdf

1、目的：1、HPLC色譜法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞來(lái)源的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)；2、研究MCF-7細(xì)胞來(lái)源的HS對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖、凋亡的調(diào)控作用，及對(duì)GRP78蛋白和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)的影響，探討HS體外抗乳腺癌作用的機(jī)制。
　　方法：1、HS鏈的提取、純化及 HPLC分析培養(yǎng)人乳腺上皮癌細(xì)胞MDA-MB-231及MCF-7，收集匯合期培養(yǎng)液，DEAE-Sepharos

2、e-CL-6B離子交換色譜分析、透析、蛋白含量測(cè)定；硫酸軟骨素酶（Chondroitinase ABC）化學(xué)降解、冷凍干燥，鏈霉蛋白酶（Pronase）降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan, HSPG）的核心蛋白；或肝素酶Ⅰ（HeparinaseⅠ）化學(xué)降解、冷凍干燥，鏈霉蛋白酶降解硫酸軟骨素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan, CSPG）的核心蛋白，冷凍干燥

3、備用。收集上述各步提取物，分別于HPLC分析。2、HS鏈的體外抗乳腺癌實(shí)驗(yàn)用不同濃度的MCF-7細(xì)胞來(lái)源的HS處理MDA-MB-231細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察用藥前后受試細(xì)胞形態(tài)的變化；噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；流式細(xì)胞儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；蛋白質(zhì)印跡(western blotting)法檢測(cè)GRP78和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)。
　　結(jié)果：1、HPLC分析證實(shí)經(jīng)酶解后最終

4、所得細(xì)胞合成物為HS鏈。2、HS鏈可致MDA-MB-231細(xì)胞變圓、漂浮、空泡、輪廓模糊，大劑量組（HS1000μg/ml）出現(xiàn)了大量的細(xì)胞碎片。3、不同濃度的HS均能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖（P﹤0.01），大劑量組HS1000μg/ml的抑制作用最強(qiáng)，作用72h后，最大抑制率為79.08％。4、HS可誘導(dǎo) MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡。且隨著 HS濃度的提高，凋亡率明顯增高(P<0.01)。250μg/ml、500μg/m

5、l、1000μg/ml的HS作用24h后，細(xì)胞凋亡率依次為8.35%、16.06%、24.72%。5、HS抑制MDA-MB-231細(xì)胞GRP78的合成，下調(diào)GRP78的表達(dá)，且藥物濃度越大,抑制作用越明顯,與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)。6、HS可下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞的Bcl-2蛋白的表達(dá)（P<0.05）,上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)（P<0.05），并且藥物濃度越大,作用效果越明顯。與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05