rhTWEAK在乳腺癌中對TRAF1誘導作用的體外研究.pdf

1、腫瘤壞死因子樣微弱誘導劑(TNF-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)，作為TNF配體家族成員之一，為Ⅱ型跨膜蛋白，主要與細胞表面的TNF受體家族成員-Fn14(fibroblast growth factor inducible14)結合形成信號復合物來發(fā)揮廣泛的生物學活性，如：介導細胞凋亡、誘導細胞的分化、移行和粘附，還可誘導內皮細胞增殖和血管形成。而目前發(fā)現(xiàn)的7種腫瘤壞死因子受體相關因子(Tu

2、mor necrosis factor receptor-associated factors，TRAFs)家族成員(TRAF1-7)，作為一類重要的細胞銜接蛋白，能夠與多種細胞表面受體的胞漿部分結合，參與多個細胞內信號轉導通路的活化，包括NF-κB和JNK通路。這7種成員盡管都含有TRAF同源結構域，但是在信號轉導過程中所起到的作用卻不盡相同，其中以TRAF1最為特殊，因其不僅在正常組織中表達局限，而且是TRAFs家族中唯一不含有TR

3、AFN端環(huán)指結構域的成員。目前，國內外關于TRAF1在信號通路中的作用及其作用方式存在不同看法：有些研究認為TRAF1在TNFR家族誘導的NF-κB活化中作為負性調控子存在；另外一些研究則表明，在細胞系中外源性轉染TRAF1使之過表達可促進NF-κB活化。而且關于乳腺癌中TRAF1在TWEAK誘導的NF-kB活化中的作用研究，目前國內外未見報道。 本實驗主要利用免疫熒光檢測幾種不同乳腺癌細胞系中Fn14的表達情況，利用Weste

4、rn Blot和免疫共沉淀檢測在rhTWEAK(重組人TWEAK)刺激下幾種乳腺癌細胞系中TRAF1表達改變的情況，以及經過rhTWEAK刺激之后是否發(fā)生了NF-κB信號通路的活化。 材料與方法： 一、材料 正常乳腺上皮細胞系MCF-10A，人雌激素受體非依賴性乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s。 二、主要試劑和來源 羊抗人多克隆anti-Fn14抗體(sc-27141)、鼠

5、抗人單克隆anti-TRAF1抗體(sc-6253)鼠抗人單克隆anti-TRAF2抗體(sc-7346)均購自美國Santa Cruz公司。鼠抗人單克隆anti-Phospho-IkBα抗體(＃9246)購自Cell signaling公司。人重組TWEAK(rhTWEAK)(＃310-06)購自Peprotech公司。DAB酶底物顯色試劑盒(ZLI-9032)和辣根酶標記第二抗體(ZB-2301)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。免

6、疫共沉淀相關μColumns(Order No.130-042-701)和μMACS Protein GMicroBeads(Order No.130-071-101)購自德國Miltenyi Biotec公司。DMEM高糖、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自GIBCO公司。胰酶(Order No.27250018)購自美國Invitrogen公司。Western blot及IP細胞裂解液(Order No.P0013)購自碧云天生物

7、技術研究所。 三、方法 1、應用免疫熒光方法檢測Fn14在培養(yǎng)的正常乳腺上皮細胞系MCF-10A，乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中的表達。 2、應用Western blot方法檢測經rhTwEAK刺激之后，培養(yǎng)的正常乳腺上皮細胞系MCF-10A，乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中TRAF1表達改變的情況。 3、應用免疫共沉淀方法檢測經rhTWEAK刺激之后

8、，培養(yǎng)的正常乳腺上皮細胞系MCF-10A，乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中與TRAF2呈結合狀態(tài)的TRAF1表達改變的情況。 4、應用Western blot方法檢測經rhTWEAK刺激之后，培養(yǎng)的乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中NF-kB信號通路的活化情況。 5、應用SPSSl2.0統(tǒng)計分析軟件，對TRAF1在各細胞系中的表達量以及TRAF1與TRAF2在各細胞系中的

9、結合量進行方差分析及其兩兩檢驗，p<0.05為有統(tǒng)計學意義，p<0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。 結果： 1、免疫熒光方法檢測Fn14在正常乳腺上皮細胞系及乳腺癌細胞系中的表達 (1)在乳腺癌細胞系MDA-MB-231中Fn14陽性表達。 (2)在正常乳腺上皮細胞系MCF-10A和乳腺癌細胞系MDA-MB-435s中未觀察到Fn14的表達。 2、Western blot方法檢測 經rhTWEA

10、K刺激后TRAF1在正常乳腺上皮細胞系及乳腺癌細胞系中的表達 (1)以不同濃度的rhTWEAK與三株細胞系分別孵育24h后收集細胞，經Western blot結果顯示，F(xiàn)n14陽性表達的細胞系MDA-MB-231中TRAF1呈濃度依賴性表達上調(P<0.01)，而Fn14陰性表達的細胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中TRAF1則呈濃度依賴性表達下調(P<0.01)。 (2)以100ng/ml的rhTWEAK同三

11、株細胞系分別孵育，按照設計的時間點收集細胞，經Western blot結果顯示，F(xiàn)n14陽性表達的細胞系MDA-MB-231中TRAF1呈時間依賴性表達上調(P<0.01)，而Fn14陰性表達的細胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中TRAF1則呈時間依賴性表達下調(P<0.01)。 3、免疫共沉淀檢測 經rhTWEAK刺激后TRAF1和TRAF2在正常乳腺上皮細胞系及乳腺癌細胞系中的結合情況 (1)TRA

12、F1與TRAF2在MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-435s三種細胞系中均結合。 (2)以100ng/ml的rhTWEAK同三株細胞系分別孵育24h后收集細胞，與TRAF2呈結合狀態(tài)的TRAF1在Fn14陽性表達的細胞系MDA-MB-231中表達明顯上調(P<0.01)，而在Fn14陰性表達的細胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中表達下調(P<0.05)。 4、Western blot方法檢測

13、 經rhTWEAK刺激后乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中NF-kB信號通路的活化情況 (1)在MDA-MB-231中，經rhTWEAK刺激之后出現(xiàn)了短暫(15-30min)的I-kBα的磷酸化。 (2)在MDA-MB-435s中則沒有觀察到一過性的I-kBα的磷酸化。 結論： 1、Fn14在乳腺癌細胞系MDA-MB-231中陽性表達，在正常乳腺上皮細胞系MCF-10A和乳腺

14、癌細胞系MDA-MB-435s中不表達。 2、rhTWEAK對TRAF1的誘導作用表現(xiàn)為在Fn14陽性表達的細胞系MDA-MB-231中呈濃度和時間依賴性上調，而在Fn14陰性表達的細胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中呈濃度和時間依賴性下調。 3、rhTWEAK可以誘導Fn14陽性表達的細胞系MDA-MB-231中NF-kB信號通路的活化。 以上結論提示在乳腺癌細胞系中，rhTWEAK對TRAF1的誘導