Fn14影響TRAF1、TRAF2的結(jié)合調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路及乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為.pdf

1、乳腺癌占所有女性腫瘤的25％，是迄今為止全球女性最常見的惡性疾病。致死原因大多是原發(fā)腫瘤細(xì)胞經(jīng)血道或淋巴道轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器官?；蛱卣饕芽梢远x乳腺癌的生物學(xué)分類，但其侵襲轉(zhuǎn)移的分子學(xué)基制還研究很少。最近研究發(fā)現(xiàn)纖維生長因子誘導(dǎo)14(Fibroblast growth factor inducible14，F(xiàn)n14)是一種腫瘤特異的細(xì)胞表面標(biāo)記物，已發(fā)現(xiàn)其在食管癌，肝癌，乳腺癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中有異常高表達(dá)。腫瘤中Fn14基因激活的機(jī)制尚不明確

2、。Fn14同其它腫瘤壞死因子受體(Tumor Necrosis Factor Receptor Associated，TNFR)超家族成員一樣沒有固有的蛋白激酶活性，但可以和接頭分子結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路包括：NF-κB，JNK，ERK和p38活化。 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor，TRAFs)就是一組參與TNFR超家族信號(hào)途徑的接頭分

3、子，其中TRAFs(TRAF1，2，3，5)可分別連接到有重疊但不相同的鼠Fn14的胞質(zhì)區(qū)。Fn14與TRAFs的作用機(jī)制尚無明確報(bào)道。已經(jīng)有大量研究證實(shí)，在TRAFs家族所有成員中，TRAF1與TRAF2的關(guān)系最為密切。但是對(duì)于TRAF1，TRAF2的具體作用，一直存在著一些矛盾的觀點(diǎn)。 目前尚無Fn14影響TRAF1，TRAF2結(jié)合從而影響NF-κB通路及乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的報(bào)道。我們研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞系中Fn14的表達(dá)可

4、調(diào)節(jié)TRAF1，TRAF2的結(jié)合量及Fn14分別與TRAF1，TRAF2的結(jié)合量，影響NF-κB信號(hào)通路，同時(shí)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖，凋亡，侵襲力。 材料與方法： 1、細(xì)胞：正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，人雌激素受體非依賴性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 2、轉(zhuǎn)染：按照LipofectAMINE2000說明書操作。

5、 3、免疫熒光：檢測(cè)細(xì)胞中Fn14蛋白的表達(dá)。 4、RT-PCR：檢測(cè)Fn14mRNA表達(dá)情況。 5、免疫共沉淀：檢測(cè)Fn14、TRAF1、TRAF2蛋白之間的結(jié)合。 6、Western blot：檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435s轉(zhuǎn)染前后NF-κB信號(hào)通路的活化情況。 7、流式細(xì)胞儀檢測(cè)：按照細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒操作說明進(jìn)行，Hoechst/PI雙標(biāo)后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢

6、測(cè)凋亡發(fā)生的比例。 8、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法：接種各組細(xì)胞至96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24-120h，按照操作說明進(jìn)行，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔在490nm處的吸光值(A490)，根據(jù)吸光值繪制細(xì)胞增殖曲線。 9、Transwell小室檢測(cè)：接種各組細(xì)胞分別至Matrigel包被的含有微孔濾膜的Transwell小室，分別培養(yǎng)24h后，4％多聚甲醇固定，蘇木素染色，顯微鏡觀察細(xì)胞體外侵襲能力的變化。 10、使用SP

7、SS14.0統(tǒng)計(jì)軟件：進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-WT-Fn14上調(diào)TRAF1、TRAF2的結(jié)合，F(xiàn)n14與TRAF1的結(jié)合，F(xiàn)n14與TRAF2的結(jié)合，I-κBα的磷酸化水平 免疫共沉淀結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-WT-Fn14的MDA-MB-435s細(xì)胞組TRAF1與TRAF2蛋白結(jié)合量明顯增高，F(xiàn)n14與TRAF1蛋白結(jié)合量，F(xiàn)n14與TRAF2蛋白結(jié)

8、合量明顯增高，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 Western blot顯示：轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-WT-Fn14的MDA-MB-435s細(xì)胞組I-κBα的磷酸化水平增高。 2、轉(zhuǎn)染Fn14SiRNA下調(diào)TRAF1、TRAF2的結(jié)合，F(xiàn)n14與TRAF1的結(jié)合，F(xiàn)n14與TRAF2的結(jié)合，I-κBα的磷酸化水平。免疫共沉淀結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染Fn14SiRNA的MDA-MB-231細(xì)胞組TRAF1與TR

9、AF2蛋白結(jié)合表達(dá)量明顯減低，F(xiàn)n14與TRAF1蛋白結(jié)合量，F(xiàn)n14與TRAF2蛋白結(jié)合量明顯減低，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。Western blot顯示：轉(zhuǎn)染Fn14SiRNA的MDA-MB-231細(xì)胞組I-κBα的磷酸化水平減低。 3、轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-WT-Fn14誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖侵襲能力，抑制細(xì)胞凋亡。MTT法測(cè)定結(jié)果顯示：pcDNA3.0-WT-Fn14質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖能力明顯高于空白對(duì)

10、照組和lipo對(duì)照組(P<0.01)；而對(duì)照細(xì)胞間相比無明顯差異(P>0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-WT-Fn14組細(xì)胞凋亡率13.3±1.05％，明顯低于對(duì)照組細(xì)胞41.5±2.15％(P<0.01)。Transwell侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示：MDA-MB-435s細(xì)胞的侵襲相對(duì)數(shù)為18.7±3.5，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-WT-Fn14的MDA-MB-435s細(xì)胞的侵襲相對(duì)數(shù)為67.0±2.6。轉(zhuǎn)染pcDNA3.

11、0-WT-Fn14組細(xì)胞的侵襲相對(duì)數(shù)明顯高于對(duì)照組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 4、轉(zhuǎn)染Fn14SiRNA抑制細(xì)胞的增殖侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MTT法測(cè)定結(jié)果顯示：Fn14siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖能力明顯低于空白對(duì)照組和lipo對(duì)照組(p<0.01)；而各對(duì)照細(xì)胞相比無明顯差異(p>0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染Fn14siRNA組細(xì)胞凋亡率42.6±4.56％，明顯高于對(duì)照組細(xì)胞54.0±3.7％(p

12、<0.01)。Transwell侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示：MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲相對(duì)數(shù)為29±1.6，轉(zhuǎn)染Fn14SiRNA的MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲相對(duì)數(shù)為7.6±3.5。轉(zhuǎn)染Fn14SiRNA組細(xì)胞侵襲相對(duì)數(shù)明顯低于對(duì)照組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。 結(jié)論： pcDNA3.0-WT-Fn14質(zhì)粒能有效誘導(dǎo)MDA-MB-435s細(xì)胞中TRAF1與TRAF2的結(jié)合，F(xiàn)n14與TRAF1的結(jié)合，F(xiàn)n14