Notch1胞內區(qū)聯合EGFR抑制劑對EGFR陽性乳腺癌細胞生物學行為的影響.pdf

1、第一部分 Notch1胞內區(qū)(Notch1-IC)對EGFR陽性乳腺癌細胞生物學行為的影響
　　 研究背景：
　　 乳腺癌是嚴重威脅女性健康的惡性疾患，是導致女性死亡的主要原因之一。闡明乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制對于探討新的起協同作用的和更有效的聯合治療方案具有重要意義。細胞的增殖分化過程受多種因素的影響，其異常將導致多種疾病及腫瘤的發(fā)生。探討腫瘤細胞異常的周期調控機制對于闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展并最終克服腫瘤具有重要意義。

2、r>　　 Notch信號是在進化中高度保守的信號傳導系統，廣泛存在于哺乳動物和無脊椎動物中，由Notch受體(Notch1-4)、Notch配體(Delta-like1、3-4和Jagged1-2)及細胞內效應分子(CSL蛋白：CBF1/Su(H)/LAG-1)組成。Notch受體為一組高度保守的跨膜蛋白質，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)組成。Notch配體通過與相鄰的同型或異型細胞表面的Notch分子胞外區(qū)結合而激活Notch分子，釋放具

3、有活性的Notch胞內區(qū)(Notch-IC)。Notch-IC進而轉移到細胞核內，通過CSL等途徑，促進Notch目標基因的轉錄。
　　 Notch信號在乳腺腫瘤中的作用最初是由于在CzechⅡ鼠中發(fā)現MMTV的插入座位而提出。在Notch1、Notch4基因中均發(fā)現了MMTV前病毒的插入，產生異常活化的Notch信號，導致鼠乳腺上皮的轉化及乳腺腺癌的發(fā)生，提示Notch信號在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但是，Notch信號

4、在人乳腺發(fā)育及腫瘤中的作用研究較少。探討Notch信號在人類乳腺癌中的表達活化情況及其在乳腺癌發(fā)展中的具體作用對于闡明人乳腺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要意義，可以為人乳腺癌的治療提供理論依據。
　　 研究目的：
　　 構建攜帶Notch1-IC的逆轉錄病毒載體，將其轉染EGFR陽性的乳腺癌細胞系MDA-MB-231，篩選出表達Notchl活化胞內區(qū)的單克隆細胞系MDA-MB-231-ICN，檢測外源性Notch1信號對乳腺癌細胞

5、生物學行為的影響，探討Notch1信號在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 研究方法：
　　 1.逆轉錄病毒的包裝及單克隆細胞系的篩選
　　 1.1逆轉錄病毒的包裝
　　 采用堿裂解法提取質粒DNA(包括包膜質粒pCMV-VSV-G、包裝質粒pKat和目的基因質粒pMSCV-ICN/GFP)。采用磷酸鈣-DNA共沉淀法，將包膜質粒、包裝質粒和目的基因質粒共轉染HEK293T細胞，構建逆轉錄病毒并收集病毒上清。

6、
　　 1.2單克隆細胞系的篩選
　　 用逆轉錄病毒感染乳腺癌細胞系MDA-MB-231，收集逆轉錄病毒感染72h后的MDA-MB-231細胞，限制性稀釋法篩選出表達Notch1活化胞內區(qū)的陽性單克隆細胞系MDA-MB-231-ICN。
　　 2.Notchl胞內區(qū)(Notch1-IC)對EGFR陽性乳腺癌細胞生物學行為的影響
　　 2.1乳腺癌細胞轉染Notch1-IC后，Notch1信號的表達檢測

7、r>　　 應用Real-time RT-PCR技術檢測Notch1及其下游效應基因mRNA水平表達情況的改變，應用 Western blot檢測相應基因蛋白水平表達情況的改變。
　　 2.2 Notch1信號對乳腺癌細胞的增殖檢測
　　 應用MTT方法檢測乳腺癌細胞系的增殖情況，應用PI染色流式細胞術檢測細胞周期分布，應用Real-time RT-PCR技術檢測細胞周期相關蛋白CyclinD、CDK2、P21基因mRN

8、A水平表達情況的改變，應用Western blot檢測相應基因蛋白水平表達情況的改變，應用Annexin V/PI染色流式細胞術檢測細胞早期凋亡和晚期凋亡情況。
　　 研究結果：
　　 1.逆轉錄病毒的包裝及單克隆細胞系的篩選
　　 1.1逆轉錄病毒的包裝
　　 HEK293T細胞為有效的逆轉錄病毒包裝細胞，質粒共轉染后可產生高滴度病毒。我們成功轉染HEK293T細胞，發(fā)現48-72h熒光強度最高，于此時

9、收集病毒上清，備用。
　　 1.2單克隆細胞系的篩選
　　 逆轉錄病毒感染MDA-MB-231細胞72h后，其熒光強度最高，收集此時的細胞，采用限制性稀釋法篩選陽性單克隆細胞系。成功篩選出穩(wěn)定表達Notch1活化胞內段的單克隆細胞系MDA-MB-231-ICN。
　　 2.Notch1胞內區(qū)(Notch1-IC)對EGFR陽性乳腺癌細胞生物學行為的影響
　　 2.1乳腺癌細胞轉染Notch1-IC后，No

10、tch1信號的表達增強
　　 Real-time PCR結果顯示，MDA-MB-231-ICN細胞Notch1基因在mRNA水平的表達高于MDA-MB-231細胞，提示轉染后外源性Notch1信號可以促進Notch1基因的轉錄。Western blot的結果與Real-time PCR結果一致，提示Notch1蛋白的表達增加。Notch1下游效應基因Hes1在mRNA和蛋白水平的表達均增加，提示Notch1信號的活化。Notch

11、1下游效應基因Hey1的表達也增加，進一步證實Notch1信號的活化。
　　 2.2 Notch1信號促進乳腺癌細胞的增殖
　　 MTT結果顯示，MDA-MB-231-ICN細胞的增殖速度高于MDA-MB-231細胞。細胞周期分析結果顯示，MDA-MB-231-ICN細胞G0期的細胞顯著低于MDA-MB-231細胞，提示細胞周期的進展。細胞周期相關蛋白的檢測發(fā)現，與MDA-MB-231細胞相比，MDA-MB-231-IC

12、N細胞CyclinD和CDK2在mRNA水平的表達均增加，而P21的表達降低，蛋白水平的表達結果與mRNA的結果一致，即CyclinD和CDK2蛋白的表達增加，而P21蛋白的表達降低。細胞周期相關蛋白的檢測結果支持細胞周期分布的變化。細胞凋亡分析結果顯示，MDA-MB-231-ICN細胞的早期凋亡和晚期凋亡率均低于MDA-MB-231細胞。
　　 結論：
　　 我們通過構建攜帶Notch1-IC的逆轉錄病毒載體，將其轉染

13、EGFR陽性的乳腺癌細胞系MDA-MB-231，成功篩選出表達Notch1活化胞內區(qū)的陽性單克隆細胞系MDA-MB-231-ICN，結果顯示轉染后Notch1信號的表達和活化增加。高表達的Notch1信號促進乳腺癌細胞系的增殖，抑制細胞凋亡，促進細胞周期進展，表明Notch1信號在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的促進作用。本研究對闡明人乳腺癌的發(fā)病機制具有重要作用。
　　 第二部分 EGFR聯合Notchl信號在EGFR陽性乳腺

14、癌發(fā)生中的作用
　　 研究背景：
　　 細胞的增殖分化過程受多種信號通路的調控，他們之間不是孤立的發(fā)揮作用，而是在一個復雜的細胞信號網絡中相互作用，共同調節(jié)細胞的各項生命活動。研究腫瘤細胞異常的周期調控機制對于闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制并最終克服腫瘤具有重要意義。Notch和EGFR信號轉導系統普遍存在于機體組織細胞中，二者相互關聯，精確調控細胞周期進展。Notch和EGFR信號在腫瘤發(fā)病機制中的作用已成為研究重點。

15、　　 Notch信號系統廣泛存在于哺乳動物和無脊椎動物中，在進化中高度保守。Notch受體活化后，釋放具有活性的Notch胞內區(qū)，Notch-IC轉移到細胞核內，激活包括Hes在內的效應器，抑制分化相關基因的轉錄，最終達到抑制細胞分化、使細胞保持較原始階段的目的。
　　 EGFR信號是機體的另一條重要信號轉導途徑，廣泛存在于上皮、間質及神經組織，貫穿于整個細胞的生長和增殖過程，對細胞的分化選擇起重要的調節(jié)作用。EGFR家族主要

16、包括EGFR(即 HER1)和HER2-4。EGFR信號經受體酪氨酸磷酸化被激活，通過Ras/Raf/MEK/MAPK途徑級聯放大，最后導致MAPK的磷酸化，修飾的MAPK信號進入細胞核，促進目標基因的磷酸化，調節(jié)基因的表達和活性。EGFR信號與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關，在多種腫瘤如肺癌、結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌及膀胱癌等中均有表達。高表達的EGFR信號可以促進腫瘤細胞的增殖，新生血管的形成，腫瘤的侵襲和轉移等。患者常對化療

17、藥物發(fā)生抵抗，預后較差。以EGFR為靶點的研究結果已有報道，EGFR反義RNA體外可以抑制細胞的增殖，誘導細胞凋亡。EGFR抑制劑可以引起卵巢癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌及前列腺癌等多種腫瘤細胞生長受抑，起到抑癌的作用，并且EGFR抑制劑可以增強多種抗腫瘤藥物的細胞毒作用。
　　 在乳腺癌中，Notch與EGFR信號的相互作用還不清楚。本研究預期目標的實現將會明確EGFR信號在惡性乳腺癌中的作用，闡明乳腺癌中Notch1和EGFR信

18、號的相互關系，進一步揭示惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，為腫瘤的基因治療提供實驗依據。
　　 研究目的：
　　 應用EGFR抑制劑gefitinib來抑制EGFR的信號活性，探討EGFR信號對人乳腺癌細胞系生物學活性的影響，揭示EGFR與Notch1信號間的相互作用及機制。
　　 研究方法：
　　 1.EGFR抑制劑對乳腺癌細胞生物學行為的影響及機制
　　 1.1 EGFR抑制劑對乳腺癌細胞生物學行為的影

19、響
　　 選用人乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MCF-7為研究對象，在EGFR抑制劑使用前后，應用MTT方法檢測乳腺癌細胞系的增殖情況，應用PI染色流式細胞術檢測細胞周期分布，應用Annexin V/PI染色流式細胞術檢測細胞早期凋亡和晚期凋亡情況。
　　 1.2 EGFR抑制劑對Notch1和EGFR信號表達的影響
　　 應用Real-time RT-PCR技術檢測EGFR抑制劑使用前后Notch1和EGF

20、RmRNA水平表達情況的改變。
　　 2.Notch1與EGFR信號在乳腺癌發(fā)生中的相互作用
　　 選用MDA-MB-231細胞和MDA-MB-231-ICN細胞為研究對象，比較EGFR抑制劑使用前后乳腺癌細胞生物學活性的改變。應用MTT方法檢測乳腺癌細胞系的增殖情況，應用PI染色流式細胞術檢測細胞周期分布，應用Real-time RT-PCR技術檢測Notch1和EGFR以及細胞周期相關蛋白CyclinD、CDK2、P

21、21基因mRNA水平表達情況的改變，應用Annexin V/PI染色流式細胞術檢測細胞早期凋亡和晚期凋亡情況。
　　 研究結果：
　　 1.EGFR抑制劑對乳腺癌細胞生物學行為的影響及機制
　　 1.1 EGFR抑制劑對乳腺癌細胞生物學行為的影響
　　 與DMSO溶劑對照相比，使用EGFR抑制劑后，MTT結果顯示乳腺癌細胞的增殖均降低，細胞周期分析結果顯示乳腺癌細胞G0/G1期的細胞比率均顯著升高，細胞凋

22、亡分析結果顯示乳腺癌細胞的早期和晚期凋亡率均增加。
　　 1.2 EGFR抑制劑對Notch1和EGFR信號表達的影響
　　 Real-time PCR的結果顯示使用EGFR抑制劑后，MDA-MB-231和MCF-7細胞中Notch1和EGFR的表達均降低，表明EGFR信號的活性降低，提示EGFR與Notch1信號存在相互作用。
　　 2.Notch1與EGFR信號在乳腺癌發(fā)生中的相互作用
　　 Real

23、-time PCR的結果顯示使用EGFR抑制劑后，MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN細胞中Notch1和EGFR的表達均降低，但Notch1和EGFR在MDA-MB-231-ICN細胞中降低的幅度低于相應的MDA-MB-231細胞。
　　 MTT結果顯示使用EGFR抑制劑后，MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN細胞的增殖均低于溶劑對照，但MDA-MB-231-ICN細胞的增殖速度高于相應的MDA-M

24、B-231細胞。
　　 細胞周期分析結果顯示使用EGFR抑制劑后，MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN細胞G0/G1期的細胞均顯著高于溶劑對照，但MDA-MB-231-ICNG0/G1期的細胞仍低于相應的MDA-MB-231 Go/G1期細胞。細胞周期相關蛋白的檢測發(fā)現使用EGFR抑制劑后，MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN細胞CyclinD和CDK2在mRNA水平的表達均降低，而P21的表達升高。

25、
　　 細胞凋亡分析結果顯示，MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN細胞的早期凋亡和晚期凋亡率均增加，但MDA-MB-231-ICN細胞的早期凋亡和晚期凋亡率均低于相應的MDA-MB-231細胞。
　　 結論：
　　 EGFR抑制劑抑制人乳腺癌細胞系的增殖，導致細胞周期阻滯和細胞凋亡增加，提示EGFR信號在人乳腺癌中發(fā)揮正調控作用?；罨腘otch1信號可以部分逆轉EGFR抑制劑對乳腺癌細胞的細胞毒作