槐耳清膏治療乳腺癌分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　惡性腫瘤是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)身體健康的疾病，隨著當(dāng)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究也隨之進(jìn)步，人們已經(jīng)充分認(rèn)識(shí)到腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響了女性身心健康。近年來(lái)乳腺癌已成為發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，且有年輕化傾向。乳腺癌的治療以手術(shù)為主，術(shù)后輔助放化療雖可改善患者的總生存和無(wú)病生存率，但易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

2、蒽環(huán)類(lèi)/紫杉醇類(lèi)化療藥物的先后問(wèn)世，是乳腺癌內(nèi)科治療的一次重大突破，使乳腺癌的治愈率進(jìn)一步得到了提高，但由于臨床上一線和二線的廣泛使用，大大增加了蒽環(huán)類(lèi)及紫衫類(lèi)藥物的耐藥性。盡管新的藥物在不斷涌現(xiàn)，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療效果并不理想，曲妥珠單抗使HER2過(guò)表達(dá)乳腺癌患者能夠獲益，但治療效果很有限。目前有關(guān)藥物防治乳腺癌的效果尚不理想，或因毒副作用限制了其臨床使用，中草藥由于具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡作用，能增強(qiáng)患者生活質(zhì)量和抗病能力

3、，減少因手術(shù)、放化療等損傷性治療給患者帶來(lái)的不良反應(yīng)，而且其毒副反應(yīng)小，價(jià)格低廉，因此從中草藥中尋找具有抗乳腺癌的天然生理活性物質(zhì)或先導(dǎo)化合物并了解其抗腫瘤作用的機(jī)制具有十分重要意義。
　　槐耳是一種生長(zhǎng)在古槐樹(shù)上的藥用真菌—槐栓菌，早在1500多年前就已經(jīng)被作為藥物用于治療各種疾病，其功效主要有止血、止痢、抗癌、崩漏、痢疾、肝炎等?；倍甯酁檎婢倍|(zhì)發(fā)酵后的熱水提取產(chǎn)物，其主要抗癌活性成分為槐耳蛋白多糖（PS-T），含有多種

4、有機(jī)成分和礦物質(zhì)元素，具有扶正固本，活血化瘀作用。能誘導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，改善患者生活質(zhì)量，同時(shí)對(duì)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移也具有一定的抑制效果，在乳腺癌的治療中發(fā)揮著非常重要的作用。本課題以乳腺癌細(xì)胞系為研究對(duì)象，探討槐耳清膏對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。從microRNA水平研究槐耳清膏對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制，觀察抑癌基因miR-126的變化，進(jìn)一步―尋本溯源‖，探討其對(duì)SOX2蛋白表達(dá)的影響。構(gòu)建裸鼠異種乳腺癌移

5、植瘤模型，研究槐耳清膏對(duì)MCF-7細(xì)胞致瘤性的影響，從而為臨床槐耳清膏治療乳腺癌提供理論依據(jù)。觀察槐耳顆粒聯(lián)合化療與單純化療在治療乳腺癌術(shù)后患者的生活質(zhì)量和免疫功能的影響，為臨床推廣應(yīng)用及進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞各加入3mg/mL、6mg/mL、9mg/mL的槐耳清膏處理48小時(shí)，用MTT比色法測(cè)定OD值，計(jì)算其抑制率，同時(shí)觀察細(xì)胞周期變化；流式細(xì)胞

6、儀檢測(cè)槐耳清膏對(duì)凋亡的影響；縈光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。
　　2.槐耳清膏處理后的MCF-7細(xì)胞，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)與乳腺癌相關(guān)的miRNA表達(dá)普情況；PCR測(cè)定槐耳清膏作用于MCF-7細(xì)胞后， miR-126的表達(dá)水平；MTT檢測(cè)槐耳清膏對(duì)轉(zhuǎn)染了miR-126 inhibitor的MCF-7細(xì)胞的增殖情況；生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合文獻(xiàn)查閱提示SOX2可能是miR-126的靶基因，并采用PCR對(duì)靶基因mRNA表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，運(yùn)

7、用Western-Blot檢測(cè)SOX2蛋白的表達(dá)水平。
　　3.將裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組給予槐耳清膏灌胃（濃度150mg/mL），每次灌胃0.2mL，每天兩次，共30天。對(duì)照組：每只裸鼠每次灌胃0.9％生理鹽水0.2mL，每天兩次，共30天。觀察裸鼠瘤體積及瘤體重的變化，顯微鏡觀察移植瘤組織病理變化特點(diǎn)，并運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)兩組裸鼠移植瘤組織中miR-126表達(dá)的差異。
　　4.經(jīng)病理學(xué)檢查確診的乳腺癌術(shù)后患

8、者90例，隨機(jī)分為兩組，治療組：應(yīng)用―FEC‖方案化療（環(huán)磷酰胺0.6/m2，靜脈推注，d1，表阿霉素100mg/m2，靜脈滴注，d1，5-氟尿嘧啶0.6/m2，靜脈滴注，d1），同時(shí)口服槐耳顆粒，20克/次，3次/日，21天為一周期；對(duì)照組單純行―FEC‖方案化療，化療前后測(cè)定兩組患者外周血NK細(xì)胞、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值，并觀察生活質(zhì)量的變化。
　　結(jié)果：
　　1．MTT法檢測(cè)不同濃度槐耳清膏作用于乳

9、腺癌MCF-7細(xì)胞48h后的抑制率，與陰性對(duì)照組比較，各濃度組的OD值呈逐漸下降，在槐耳清膏濃度為3、6、9mg/mL時(shí)其細(xì)胞抑制率分別為（17.4±1.4）%、（58.6±3.7）%、（76.1±2.9）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?；倍甯嘧饔糜谌橄侔㎝DA-MB-231細(xì)胞48h后，與陰性對(duì)照組比較，各濃度組的OD值變化不大，在槐耳清膏濃度為3、6、9mg/mL時(shí)其細(xì)胞抑制率分別為（10.3±1.7）%、（15.1±2.

10、6）%、（17.8±3.9）%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同濃度槐耳清膏作用于MCF-7細(xì)胞48h后，早期凋亡比率分別為25.4%、39.1%和50.6%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而晚期凋亡比率分別為6.27%、7.58%和8.04%，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。不同濃度槐耳清膏作用于MDA-MB-231細(xì)胞48h后，早期凋亡比率分別為1.44%、1.79%和1.56%，晚期凋亡比率分別為5.54%、7.62%和

11、7.99%，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?；倍甯喔鳚舛冉M與MCF-7細(xì)胞作用后均可發(fā)生細(xì)胞增殖抑制，各濃度組作用24h后細(xì)胞抑制率分別為（10.7±3.8）%、（42.6±4.3）%、（54.9±4.6）%，作用36h后分別為（15.4±2.2）%、（47.9±5.4）%、（62.7±1.5）%，作用48h后分別為（17.4±1.4）%、（58.6±3.7）%、（76.1±2.9）%，陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率分別為（2.8±1.

12、3）%、（2.6±1.5）%、（3.1±1.2）%，槐耳清膏各濃度組與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。通過(guò)MTT來(lái)測(cè)定細(xì)胞周期分布情況，槐耳清膏不同濃度組處于G0/G1期細(xì)胞比例分別為59.62%、62.19%、65.84%，分布于S期細(xì)胞比例分別為15.74%、13.18%、10.94%，分布于G2/M期細(xì)胞比例分別為24.64%、24.63%、23.22%，而對(duì)照組分布于G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞比例分別為44.52

13、%、21.87%、33.61%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05?？M光顯微鏡下觀察經(jīng)槐耳清膏處理48h后的MCF-7細(xì)胞，可見(jiàn)部分細(xì)胞核膜皺縮，核變小，染色質(zhì)濃聚，縈光明顯增強(qiáng)，呈亮藍(lán)色大小不等的碎片狀，并可出現(xiàn)濃縮且邊緣聚集分布，細(xì)胞邊緣不太完整，細(xì)胞核內(nèi)可出現(xiàn)濃染致密的縈光顆粒，細(xì)胞核可見(jiàn)新月形改變，固縮或片段的核，證明細(xì)胞發(fā)生了凋亡；而對(duì)照組細(xì)胞核染色體多呈橢圓形，內(nèi)有染色較淡的藍(lán)色顆粒，邊緣完整清晰。
　　2．在槐耳清膏處

14、理后的乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞中檢測(cè)與乳腺癌相關(guān)的miRNA表達(dá)譜的情況，發(fā)現(xiàn)在MCF-7細(xì)胞中上調(diào)和下調(diào)的miRNA分別有6個(gè)和21個(gè)，在MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)和下調(diào)的miRNA分別有3個(gè)和24個(gè)，miR-21-5p在MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞被同時(shí)上調(diào)，有20個(gè)miRNA被同時(shí)下調(diào)。但在MCF-7細(xì)胞中，上調(diào)大于2倍的miRNA有miR-7-5p、miR-21-5p、miR-126-3p，其中mi

15、R-126上調(diào)最為明顯。結(jié)合前期槐耳清膏對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡影響顯著，所以我們選擇經(jīng)槐耳清膏處理后的MCF-7細(xì)胞中，發(fā)生上調(diào)的miR-126作進(jìn)一步研究?；倍甯嘧饔糜趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞48小時(shí)后，我們采用RT-PCR的相對(duì)定量法來(lái)檢測(cè)miR-126的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，3mg/mL、6mg/mL和9mg/mL分別是對(duì)照組的1.44倍、2.88倍和2.51倍。轉(zhuǎn)染miR-126 inhibitor或inhibitor

16、control48h后，通過(guò)比較OD490值檢測(cè)細(xì)胞的存活情況。進(jìn)一步轉(zhuǎn)染了miR-126 inhibitor或inhibitor control的MCF-7細(xì)胞同時(shí)用6mg/ml的槐耳清膏處理48h，通過(guò)比較OD490值檢測(cè)細(xì)胞的存活情況，發(fā)現(xiàn)槐耳清膏抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用明顯被削弱。MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pRL-TK-SOX2-3‘UTR-WT/ pRL-TK-SOX2-3‘ UTR-Mut， Control/miR-126 mimi

17、c及內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒pGL3，48h后進(jìn)行報(bào)告基因檢測(cè)，共轉(zhuǎn)染pRL-TK-SOX2-3‘ UTR-WT、miR-126 mimic和pGL3質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞縈光強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組，而在pRL-TK-SOX2-3‘ UTR-Mut、miR-126 mimic和pGL3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組中縈光強(qiáng)度與對(duì)照組無(wú)差異。MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染Control/miR-126 mimic24h和48h后，分別提取MCF-7 RNA和蛋白檢測(cè)SOX2 mRNA和S

18、OX2蛋白的表達(dá)情況，與對(duì)照組比較，miR-126 mimic轉(zhuǎn)染組能明顯抑制SOX2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。
　　3．在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，每只裸鼠在接種MCF-7細(xì)胞3周后，接種部位均長(zhǎng)出腫瘤，成瘤率100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后槐耳清膏灌胃組與生理鹽水灌胃組移植瘤重分別為0.20±0.07g和0.57±0.32g，實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤體重明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），移植瘤體積分別為0.32±0.74cm3與0.84

19、±0.62 cm3，實(shí)驗(yàn)組移植瘤體積較對(duì)照組小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。肉眼觀察瘤體呈圓形、橢圓形或分葉狀包塊，質(zhì)地偏硬，包膜完整，與周?chē)M織大多分界清楚，切面呈灰白色。HE染色，實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤鏡下可見(jiàn)腫瘤組織細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的退行性變，中央及邊緣細(xì)胞出現(xiàn)大片缺血壞死區(qū)，在血供較豐富的區(qū)域表現(xiàn)尤為明顯，而在壞死灶周?chē)梢?jiàn)殘存的腫瘤細(xì)胞。對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，有異型性，形態(tài)不規(guī)則，大小不等，細(xì)胞核大、濃染，可見(jiàn)病理性核分裂相，無(wú)明

20、顯壞死區(qū)。實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤組織中表達(dá)明顯高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組miR-126的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的2.406倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4．90例乳腺癌術(shù)后患者，隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組，治療組化療聯(lián)合槐耳顆?？诜瑢?duì)照組單純行化療，兩組患者在治療前查外周血NK細(xì)胞、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值，分別為（14.73±5.21）%、（55.24±4.36）%、（35.87±4.29）%、（25.3

21、4±4.36）%、（1.14±0.35）%與（14.25±4.88）%、（56.21±4.57）%、（35.58±3.17）%、（24.26±3.16）%、（1.16±0.43）%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療2周期后查外周血NK細(xì)胞、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值，分別為（22.74±5.09）%、（65.71±3.95）%、（41.95±6.27）%、（23.72±2.47）%、（1.47±0.26）

22、%與（14.94±5.21）%、（55.34±5.43）%、（34.46±3.25）%、（23.83±3.44）%、（1.12±0.37）%，治療組治療后NK細(xì)胞、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值明顯高于治療前，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但CD8+值變化不大，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），而對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)在治療前后均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），治療后各項(xiàng)免疫指標(biāo)較治療前下降。治療組在患者治療后NK細(xì)胞、CD3+、C

23、D4+、CD4+/CD8+值均高于對(duì)照組患者治療后相應(yīng)各項(xiàng)指標(biāo)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但CD8+值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。在生活質(zhì)量評(píng)分中，治療組KPS評(píng)分提高22例（48.89%）、穩(wěn)定20例（44.44%）、下降3例（6.67%），提高率為48.89%，而對(duì)照組KPS評(píng)分提高7例（15.56%）、穩(wěn)定33例（73.33%）、下降5例（11.11%），提高率為15.56%，治療組提高率高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

24、（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．槐耳清膏對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，這種抑制效果更明顯；槐耳清膏能誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡，具有明顯的藥物濃度和時(shí)間的量效關(guān)系；槐耳清膏對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞無(wú)明顯的抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用。
　　2．槐耳清膏能上調(diào)MCF-7細(xì)胞中miR-126的表達(dá)，上調(diào)的miR-126可通過(guò)抑制靶基因SOX2蛋白的表達(dá)參與

25、到槐耳清膏抑制MCF-7細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用中，上述研究發(fā)現(xiàn)為槐耳清膏的抗腫瘤作用提供了新的分子機(jī)制。
　　3．在裸鼠體內(nèi)，槐耳清膏能抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的成瘤性，其機(jī)制可能是槐耳清膏能上調(diào)miR-126的表達(dá)，從而達(dá)到抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
　　4．槐耳顆粒能提高乳腺癌術(shù)后化療患者NK細(xì)胞、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值，但CD8+值變化不大，證明槐耳顆粒具有良好的免疫增強(qiáng)效果，能增強(qiáng)乳腺癌術(shù)后化療