槐耳清膏誘導(dǎo)肝癌小鼠移植瘤細(xì)胞凋亡的實驗研究.pdf

1、[背景] 原發(fā)性肝癌(PLC)已成為我國第二位惡性腫瘤病因，是最常見的惡性腫瘤之一。統(tǒng)計資料表明，全世界每年新發(fā)肝癌病例約45％在我國大陸。近20年來，我國肝癌死亡率增加了41.7％，可見我國肝癌高發(fā)的趨勢已十分嚴(yán)峻。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)中藥配合各種西醫(yī)常規(guī)方法治療中晚期原發(fā)性肝癌，具有明顯改善臨床癥狀及體征，提高生存質(zhì)量，延長生存期等作用。近年來，加大了對中藥的開發(fā)力度，從中藥中篩選提純出有形成份，如中藥多糖，進(jìn)行抗腫瘤實驗，取得了

2、一定的進(jìn)展，為中藥抗癌提供了一條途徑。 槐耳是生長在老齡中國槐樹干上的一種藥用真菌-槐栓菌(Trametesrobiniophila Murr)，其主要抗癌活性成分為蛋白多糖(PS-T)?，F(xiàn)已有其成品-金克槐耳顆粒(國家一類新藥)應(yīng)用于臨床。綜合現(xiàn)代文獻(xiàn)報道，槐耳顆粒在臨床上已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的治療，并取得了一定的療效：1、消化系統(tǒng)腫瘤：槐耳配合常規(guī)化療方案，能顯著提高胃癌術(shù)后的5年生存率；槐耳配合化療能提高大腸癌術(shù)后患者的免

3、疫功能，減輕化療毒性，改善造血功能；2、呼吸系統(tǒng)腫瘤：槐耳能顯著改善非小細(xì)胞肺癌患者的免疫功能；3、血液腫瘤方面：單用槐耳治療慢性粒細(xì)胞性白血病的總有效率可達(dá)80％；4、其它腫瘤：槐耳對乳腺癌腫瘤也有良好的療效。在闡述其抗腫瘤機制方面，也有進(jìn)行了大量的實驗研究。目前已有的槐耳作用于肝癌的基礎(chǔ)實驗表明，槐耳在體外可直接作用于肝癌細(xì)胞并誘導(dǎo)其凋亡，本實驗將在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究槐耳誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。 [目的] 1、體外

4、觀察槐耳清膏對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株的生長抑制作用； 2、觀察槐耳清膏對肝癌小鼠移植瘤細(xì)胞的抑制作用，并初步探討其作用機制。 [方法] 1、MTT法檢測槐耳清膏在體外對肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞株的抑制率； 2、觀察槐耳清膏對小鼠移植瘤的抑制作用及其誘導(dǎo)凋亡作用 皮下注射H22小鼠肝癌細(xì)胞，造荷瘤小鼠的模型，分為A組(空白對照組)、B組(5-Fu組)、C組(槐耳清膏組)、D組(槐耳清膏

5、+5-Fu組)，用藥結(jié)束后，稱瘤重，計算抑瘤率；HE染色，觀察瘤組織的病理學(xué)改變；TLINEL法檢測各組腫瘤組織凋亡率；用免疫組織化學(xué)的方法檢測移植瘤細(xì)胞組織相關(guān)凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)，初步探討其誘導(dǎo)凋亡的可能機制。 [結(jié)果] 1、體外抑制細(xì)胞增殖實驗：槐耳清膏對肝癌SMMC-7721細(xì)胞有明顯的抑制作用，且隨濃度增加而上升，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，10mg/ml槐耳清膏組與5mg/ml槐耳清膏組的48h抑制率分別達(dá)

6、到65％和55％。 2、體內(nèi)抑制腫瘤生長實驗：A組(對照組)荷瘤小鼠移植瘤重量明顯大于B組(5-Fu組)、C組(槐耳清膏組)和D組(槐耳清膏+5-Fu組)(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05)，B，C，D組抑瘤率分別為31.2％，27.1％，47.5％，提示槐耳清膏在體內(nèi)具有抑制腫瘤生長的作用；且D組抑瘤率明顯高于B，C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示槐耳清膏聯(lián)合5-Fu用藥，可提高5-Fu抑制腫瘤的效果。

7、 3、TUNEL法腫瘤組織細(xì)胞凋亡率的檢測顯示，凋亡率由高到低依次為：槐耳清膏聯(lián)合5-Fu組、槐耳清膏組、5-Fu組、對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 4、相關(guān)凋亡蛋白Bcl-2的測定，免疫組化結(jié)果顯示：對照組的Bcl-2陽性表達(dá)率為43.02±2.05％，明顯高于5-Fu組、槐耳清膏組、槐耳清膏聯(lián)合5-Fu組的陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明槐耳清膏可下調(diào)荷瘤小鼠瘤組織細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)。

8、 5、相關(guān)凋亡蛋白Bax的測定，免疫組化結(jié)果顯示：槐耳清膏聯(lián)合5-Fu組的Bax陽性表達(dá)率87.88±9.72％，高于對照組、5-Fu組、槐耳清膏組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；對照組與槐耳清膏組的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，表明槐耳清膏聯(lián)合5-Fu可增強Bax蛋白的表達(dá)。 [結(jié)論] 1、槐耳清膏在體外對肝癌SMMC-7721細(xì)胞有抑制其生長的作用； 2、槐耳清膏在體內(nèi)可通過誘導(dǎo)凋亡抑制小鼠移