槐耳浸膏干預(yù)肝癌增殖及轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一。近年來(lái)其發(fā)病率有不斷上升趨勢(shì)。目前臨床上治療肝癌的方法有多種，手術(shù)切除仍是最有效的治療措施之一，但遠(yuǎn)期療效有待進(jìn)一步提高。目前藥物治療存在的主要問題是：有效藥物比較少，選擇余地比較小，長(zhǎng)期應(yīng)用某種藥物不僅毒副作用大，且腫瘤極易產(chǎn)生耐藥性。故尋找新的抗腫瘤增殖和抗腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的藥物成為目前腫瘤治療的熱點(diǎn)。這新一代的抗腫瘤藥物應(yīng)該具有療效穩(wěn)定可靠，可提高機(jī)體免疫力，毒副作用小，腫瘤不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。中

2、藥尤其是藥用真菌因具備以上特點(diǎn)而倍受人們的關(guān)注。近年來(lái)槐耳顆粒在臨床上的應(yīng)用已證明其對(duì)肝癌、肺癌、食管癌、胃癌等腫瘤有獨(dú)特療效。但其抗癌機(jī)制迄今為止尚未見全面報(bào)道，尤其是在抗肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)研究方面所見報(bào)道極少。本研究目的即試圖通過(guò)槐耳浸膏干預(yù)肝癌細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)、侵襲、凋亡以及在動(dòng)物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，較為系統(tǒng)地探討槐耳浸膏抑制肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為臨床治療肝癌提供理論依據(jù)。 第一部分槐耳浸膏在體外干

3、預(yù)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的研究 腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移離不開腫瘤細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)、侵襲等環(huán)節(jié)，其中的任一環(huán)節(jié)被打斷均可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的下降或消失。槐耳浸膏抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是因主瘤細(xì)胞增殖被抑制導(dǎo)致侵襲細(xì)胞數(shù)目減少，相應(yīng)減少轉(zhuǎn)移灶形成的幾率，還是對(duì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的以上幾個(gè)環(huán)節(jié)的直接作用，目前尚不清楚。因此，我們?cè)隗w外研究了槐耳浸膏對(duì)肝癌細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、侵襲以及凋亡的影響。 (一)槐耳浸膏對(duì)MHCC97H細(xì)胞黏附作用的影響

4、DMEM和槐耳浸膏(1．Omg／ml、3．0mg／ml、5．0mg／ml、10mg／m1)分別與MHCC97H細(xì)胞預(yù)孵育24小時(shí)，重新計(jì)數(shù)后加入纖連蛋白(FN)包被的96孔板，37~C，5％C02孵育3小時(shí)，去除未黏附的細(xì)胞，加入1％亞甲蘭，用600nm波長(zhǎng)檢測(cè)黏附百分比。結(jié)果顯示：MHCC97H細(xì)胞與纖連蛋白黏附力強(qiáng)，黏附百分比為75．56~／~1．34％。經(jīng)槐耳浸膏作用后黏附能力明顯下降。統(tǒng)計(jì)結(jié)果說(shuō)明槐耳浸膏各濃度組與空白對(duì)照組相比

5、差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

6、計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示：MHCC97H細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)，空白對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為：49．64±3．19／200倍視野。經(jīng)槐耳浸膏作用24小時(shí)后，運(yùn)動(dòng)能力明顯下降，顯示出較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)抑制力。在槐耳浸膏組中，隨著濃度的增加，MHCC97H細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)逐漸減少，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果說(shuō)明各槐耳浸膏組與空白對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p

7、細(xì)胞侵襲能力的影響。 DMEM和槐耳浸膏(1．0mg／ml、3．0mg／ml、5．0mg／ml、10mg／m1)分別與MHCC97H細(xì)胞預(yù)孵育24h，重新計(jì)數(shù)后加入預(yù)鋪MatrigelMatrix的Transwell小室中。37~C,5％C029呼育24h，濾膜姬姆薩染色，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示：MHCC97H細(xì)胞侵襲力強(qiáng)，空白對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為36．68±3．70／200倍視野。經(jīng)槐耳浸膏作用24小時(shí)后，侵襲力下降，顯示出較

8、明顯的侵襲抑制作用。在槐耳浸膏組中，隨著濃度的增加，MHCC97H細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)逐漸減少，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果說(shuō)明各槐耳浸膏組與空白對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0．01)?；倍酀舛扰cMHCC97H細(xì)胞侵襲抑制率成正相關(guān)。 (四)槐耳浸膏誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究 DMEM和槐耳浸膏(1．Omg／ml、3．0mg／ml、5．0mg／ml、1Omg／m1)分別與MHCC97H細(xì)胞預(yù)孵育24h、

9、48h、72h。重新計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10％1。取100ul于5ml專用管，加入Annexin-V-FITC5ul，PI5ul,再加入1×bindingbuffer400ul。在1h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示：不同濃度槐耳浸膏在每一時(shí)段上誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡率明顯高于對(duì)照組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。各槐耳浸膏組中凋亡率的升高有明顯的劑量相關(guān)性，且誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。 第二部分槐

10、耳浸膏在體內(nèi)干預(yù)肝癌增殖及轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究 槐耳浸膏在體外有明顯的誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、侵襲的作用。但在體內(nèi)是否能抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，目前尚未知。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)槐耳浸膏干預(yù)人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞瘤株在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移以及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)來(lái)探討這一問題。24只裸鼠建立LCI-D20模型并隨機(jī)分成兩組。治療組按槐耳浸膏2g／kg給裸鼠灌胃。對(duì)照組每天灌生理鹽水。灌胃給藥體積均為0．2ml／只，每天灌胃1次。飼養(yǎng)裸鼠4周后處死裸

11、鼠。測(cè)量?jī)山M裸鼠腫瘤的重量，觀察兩組裸鼠腫瘤的肺轉(zhuǎn)移、腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝內(nèi)播散灶的數(shù)目。測(cè)定兩組裸鼠腫瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶的濃度。方法：腫瘤組織于解凍前切割，稱量。加入預(yù)冷的勻漿液(每0．1g組織加0．5m1)。在低溫下勻漿、離心，吸取上清液。將該上清液與2×的上樣緩沖液按1：1的比例混合后電泳。將凝膠先后置于1×復(fù)性緩沖液及1×顯影緩沖液中處理。考馬斯亮藍(lán)染液染色，脫色液脫色至深藍(lán)背景中亮帶出現(xiàn)。計(jì)算機(jī)掃描蛋白電泳條帶，采用Imag

12、eMasterVDS軟件分析掃描結(jié)果。結(jié)果：治療組的肺轉(zhuǎn)移灶(1／12)、肝內(nèi)播散灶(2／12)及腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)(1／12)均少于對(duì)照組(分別為6／12、7／12及5／12)；肝內(nèi)瘤重(1．18g±0．32g)小于對(duì)照組(1．78g±0．39g)；治療組肝癌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2和MMP-9分別為50．54±9．28和7．224-3．10)的含量也明顯低于對(duì)照組(分別為75．65+7．08和11．324-2．98)。兩組差異