KAI1通過調控Sprouty2和SPK抑制HGF誘導肝癌細胞遷移的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的;
　　原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例數(shù)占全世界新發(fā)病例數(shù)的比例高達42.5％，居各種腫瘤發(fā)病率的第二位；HCC的死亡率約為20/100,000，已成為農(nóng)村第一位和城市第二位的癌癥死因。HCC具有轉移早、臨床癥狀出現(xiàn)晚的特點，70％患者確診時已屬晚期，喪失了手術時機，即使直徑小于5cm的小肝癌，根治性切除后的3年復發(fā)率也高達40-50％

2、，追其原因，腫瘤細胞的轉移是阻礙進一步提高療效的最大障礙。
　　轉移是惡性腫瘤的共同生物學特征，亦是導致腫瘤患者臨床治療預后差，易復發(fā)的主要原因；但由于腫瘤細胞轉移及其調控的復雜性，至今我們對其發(fā)生的確切機制仍不清楚。因此，從分子水平闡明腫瘤轉移機制可能為臨床腫瘤的診治提供新途徑。KAI1/CD82基因于1995年首次被證實與腫瘤細胞的轉移有關，其編碼的跨膜糖蛋白具有調節(jié)細胞運動、黏附和抑制腫瘤細胞遷移、浸潤的作用。在肝癌中，臨床

3、和實驗證據(jù)都表明KAI1表達下調與轉移灶的形成及患者預后不良密切相關，KAI1能使癌細胞轉移能力明顯減弱。目前，關于KAI1能夠抑制腫瘤轉移的認識已得到學者們普遍認同，但其調控腫瘤轉移的具體作用機制仍不清楚。國外對KAI1基因作用機理的研究近年有逐漸增多的趨勢，研究思路主要傾向于探討KAI1對與腫瘤轉移相關的信號分子和信號通路的影響，并已取得了一些初步的成果，但有關KAI1抑制癌細胞遷移的作用機制仍然不十分清楚。
　　我們課題組最

4、近發(fā)現(xiàn)KAI1可下調胰腺癌細胞內(nèi)信號分子鞘氨醇激酶（SPK）的活性，為我們研究KAI1抑制腫瘤轉移的信號轉導機制奠定了初步的基礎。SPK是調節(jié)細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺（Ceramide，Cer）和1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phospate，S1P)水平的重要限速酶，可通過酶促反應維持二者的動態(tài)平衡，從而維持細胞的生理功能。Cer是一種負調控因子，抑制細胞生長、遷移、促進細胞凋亡；S1P是Cer的進一步代謝產(chǎn)物，是正調控因子，促進細

5、胞增殖、分化、遷移和抑制凋亡。Cer和S1P——這兩個鞘磷脂代謝產(chǎn)物的動態(tài)平衡決定了細胞狀態(tài)的發(fā)展方向。近年來，研究表明SPK的活性受多種與腫瘤發(fā)生和轉移密切相關的生長因子的調節(jié)，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，都可以通過MAPK等信號通路使SPK磷酸化，激活SPK，進而調節(jié)細胞內(nèi)Cer和S1P的動態(tài)平衡發(fā)展方向，最終影響腫瘤細胞的增殖、凋亡以及遷移等生物學功能。因此，SPK也被認為是與腫瘤細胞生物學特性密切相關的生長因子信號傳導途徑

6、中的一個重要信號分子。
　　Sprouty2是MAPK信號通路的抑制因子，發(fā)揮抑制細胞增殖、分化及遷移等生物學效應。腫瘤細胞大多伴有該信號通路的異常，作為負反饋抑制因子——Sprouty2也被認為有可能是一種抑癌基因，且在前列腺癌和乳腺癌等腫瘤細胞中已經(jīng)證實了這一點。那么Sprouty2和SPK——這兩個與腫瘤轉移密切相關的信號分子是否參與了KAI1對肝癌細胞轉移的抑制作用呢？本課題旨在探明KAI1對上述兩個蛋白表達及酶活性的影響

7、，以及KAI1、SPK和Sprouty2蛋白三者之間的作用關系，進一步探討KAI1抑制腫瘤轉移的信號轉導途徑。
　　研究方法:
　　本研究采用肝癌細胞系SMMC-7721細胞為研究對象。應用本室構建的攜帶KAI1基因的復制缺陷型腺病毒載體（Ad-KAI1），將該基因導入肝癌細胞，采用Transwell、劃痕實驗檢測KAI1對HGF誘導肝癌細胞遷移的影響；應用MTT、流式細胞儀檢測KAI1對SMMC-7721細胞增殖能力、凋亡

8、以及細胞周期等生物學特性的作用；WesternBlot檢測KAI1對SPK蛋白表達的影響；同位素摻入放射自顯影法檢測對酶活性的作用；Transwell檢測HGF誘導肝癌細胞遷移，以及同位素摻入放射自顯影檢測HGF對SPK的激活作用；用PI-3K、MAPK信號通路的特異性阻滯劑PD98059和LY294002預處理SMMC-7721細胞，觀察是否能阻斷HGF對SPK的激活作用，闡明HGF通過何種信號通路激活SPK；加入SPK特異性阻斷劑D

9、MS，觀察是否能阻斷HGF誘導肝癌細胞遷移，以證實SPK在HGF誘導遷移信號通路中的作用。WesternBlot檢測SMMC-7721細胞轉染KAI1后Sprouty2蛋白的表達情況和MAPK的磷酸化水平；構建攜帶靶向Sprouty2siRNA序列的慢病毒表達載體，PCR鑒定陽性克隆，感染SMMC-7721細胞，通過挑克隆和流式細胞分選儀篩選分離Sprouty2RNA干涉陽性細胞株，以WesternBlot檢測Sprouty2干涉后的表

10、達水平；觀察Sprouty2功能沉默后，KAI1對SPK以及對HGF誘導肝癌SMMC-7721細胞轉移的抑制作用是否能夠被阻斷或明顯減弱。
　　研究結果:
　　(1)KAI1抑制HGF誘導的人肝癌SMMC-7721細胞遷移。轉染Ad-KAI1后，HGF誘導的細胞遷移受到明顯的抑制，其未轉染KAI1的遷移細胞數(shù)值為109.2±6.3，轉染的遷移細胞數(shù)值為36.7±4.7，兩者差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），劃痕實驗結果也提

11、示轉染KAI1的SMMC-7721細胞遷移能力明顯下降，未轉染Ad-KAI1的細胞遷移了79.2±9.1％，而轉染Ad-KAI1的細胞僅遷移27.2±5.1％，差異具有顯著性（P<0.05)；
　　(2)KAI1對SMMC-7721細胞增殖、凋亡和細胞周期無明顯影響。轉染KAI1后細胞增殖受到輕度抑制，96h后測MTT相對OD值分別為：對照組3.33±0.19，50MOI組3.09±0.09，100MOI組2.95±0.13，15

12、0MOI組2.71±0.17，但差異不顯著；轉染KAI1后細胞凋亡變化不明顯，四組的細胞凋亡比例分別為：5.08±0.97％，8.05±1.24％，7.15±1.19％和10.72±2.71％；細胞周期亦未見明顯影響，結果顯示：G1期細胞比例分別為：72.24％，70.55％，66.70％和68.63％；
　　(3)轉染KAI1后SMMC-7721細胞內(nèi)SPK的蛋白表達及酶活性均受到明顯抑制，將未轉染KAI1的對照組設值為1，轉染

13、KAI1各組細胞SPK蛋白表達相對值分別為：50MOI組0.91±0.06，100MOI組0.64±0.03和150MOI組0.45±0.02，SPK酶活性的相對值分別為；0.83±0.04，0.76±0.02和0.59±0.06，KAI1對SPK的抑制作用存在劑量效應關系；
　　(4)HGF激活SPK的酶活性。將未加HGF刺激的對照組細胞SPK酶活性設值為1，加入不同濃度HGF刺激的細胞SPK酶活性相對值分別為：1.82±0.0

14、9，2.16±0.07；3.41±0.11，升高明顯，差異顯著（P<0.05），且HGF對SPK的激活存在劑量效應關系；
　　(5)HGF刺激誘導細胞遷移。未加HGF誘導的細胞遷移數(shù)只有19.3±2.9，25ng/mlHGF誘導遷移細胞數(shù)為97.2±7.1，50ng/mlHGF誘導遷移細胞數(shù)為115.87±17，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01)，誘導遷移作用呈明顯的劑量效應依賴關系；
　　(6)DMS阻斷HGF誘導SMMC

15、-7721細胞遷移。將肝癌細胞用SPK特異性阻滯劑DMS預處理，加入HGF誘導遷移，未加DMS的細胞遷移數(shù)為115.72±9.7，而加入DMS預處理的SMMC-7721細胞的遷移數(shù)目明顯減少，為10.1±2.6，二者比較有顯著性差異（P<0.01），DMS阻斷HGF誘導遷移的作用；
　　(7)PI-3K、MAPK信號通路阻滯劑對HGF激活SPK的影響。將SMMC-7721細胞用PI-3K、MAPK信號通路阻滯劑PD98059和LY

16、294002預處理,加入HGF，未加處理的對照組SPK酶活性為2.82±0.18，加入PD98059和LY294002預處理的細胞SPK酶活性分別為0.49±0.03和0.38±0.07；
　　(8)KAI1上調Sprouty2表達。轉染Ad-KAI1上調SMMC-7721細胞中Sprouty2蛋白的表達，將未轉染Ad-KAI1的對照組Sprouty2蛋白表達量設為1，轉染各組相對值分別為：1.18±0.04，1.56±0.03和

17、1.61±0.04，Ad-KAI1的感染強度與Sprouty2的蛋白表達呈劑量依賴的正相關；
　　(9)KAI1抑制MAPK磷酸化。轉染Ad-KAI1抑制MAPK的磷酸化，將未轉染Ad-KAI1的對照組MAPK磷酸化表達量設為1，其余轉染的各組相對值分別為：0.84±0.04，0.72±0.06和0.44±0.06；
　　(10)設計構建的靶向Sprouty2的siRNA慢病毒表達載體。PCR擴增鑒定陽性克隆，在與理論值相符

18、的300bp位置擴增出條帶，證明重組慢病毒載體帶有目的基因，將該表達載體轉染細胞，WesternBlot證實其對SMMC-7721細胞中Sprouty2的表達確有干涉作用，將未干涉的對照組Sprouty2蛋白表達量設為1，Sprouty2干涉細胞的蛋白表達量為0.35±0.01，差異顯著（P<0.01）；
　　(11)沉默Sprouty2對KAI1抑制SPK的影響。采用RNAi沉默Sprouty2功能，發(fā)現(xiàn)未干涉Sprouty2的

19、細胞KAI1使SPK活性降低達到60％左右，使SPK表達下降50％左右，而Sprouty2功能被干涉沉默后，KAI1對SPK活性的抑制率只有20％左右，對SPK表達的抑制率也只有10％，差異有統(tǒng)計學意義（酶活性：P<0.01；蛋白表達：P<0.05）；
　　(12)沉默Sprouty2對KAI1抑制癌細胞遷移的影響。在未干涉Sprouty2的細胞，KAI1能夠明顯抑制HGF誘導SMMC-7721細胞遷移，未轉染KAI1遷移細胞數(shù)為

20、156.50±9.66，轉染KAI1的遷移細胞數(shù)只有41.25±2.86，差異顯著（P<0.01）；而Sprouty2功能被沉默后，KAI1對HGF誘導細胞遷移的抑制減弱，未轉染KAI1遷移細胞數(shù)為161.41±4.85，轉染KAI1的遷移細胞數(shù)也達到120.23±11.98，無明顯差異（P>0.05）。
　　研究結論:
　　(1)KAI1顯著抑制HGF誘導的肝癌SMMC-7721細胞遷移，對該細胞系的細胞增殖、細胞周期和凋

21、亡的影響不明顯；
　　(2)KAI1抑制SMMC-7721細胞鞘氨醇激酶（SPK）蛋白表達和酶活性；
　　(3)HGF通過PI3K、MAPK通路激活SPK來傳遞誘導SMMC-7721細胞遷移的信號，SPK是HGF誘導肝癌細胞遷移信號通路中的重要信號分子；
　　(4)KAI1通過調控SMMC-7721細胞SPK的蛋白表達和酶活性，實現(xiàn)其抑制HGF誘導細胞遷移的作用；
　　(5)KAI1能夠上調SMMC-7721細胞