靶向封閉AKT1抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移的研究.pdf

1、目的：超過90%的原發(fā)性肝癌為肝細(xì)胞癌（HCC），HCC的預(yù)后較差。雖然手術(shù)治療仍是迄今為止最有效的治療，但大多數(shù)HCC患者被診斷時(shí)處于晚期，不能接受手術(shù)治療，而未經(jīng)治療的患者5年存活率僅為5%。因此，探索HCC新的治療靶點(diǎn)以發(fā)掘HCC新的有效可行的治療方法是至關(guān)重要的。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路已經(jīng)被越來(lái)越多的研究證明其在 HCC的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。AKT是PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的重要橋梁點(diǎn)，已經(jīng)有證據(jù)表明其

2、對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞活力信號(hào)方面起重要作用，并且與各種增殖性疾病密切相關(guān)。許多數(shù)據(jù)表明，單一AKT的亞型（即AKT1，AKT2和AKT3）在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中具有不同甚至相反的功能。AKT同種異型可能對(duì)癌癥傳播具有不利影響。AKT家族，也叫絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，特別是AKT1亞型已被確定在HCC細(xì)胞中異常表達(dá)，并且與細(xì)胞行為（包括增殖，存活，代謝和腫瘤發(fā)生）高度相關(guān)。然而，AKT1的調(diào)節(jié)具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。我們的研究的目的是揭示A

3、KT1對(duì)HCC細(xì)胞增殖和遷移的影響，并調(diào)查其所涉及的機(jī)制。
　　方法：用TRIzol試劑從HCC細(xì)胞（SMMC-7721，HepG2）中提取總RNA，SYBR Premix Ex Taq試劑對(duì)cDNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)基因的表達(dá)。我們使用RT-PCR來(lái)評(píng)估兩個(gè)HCC細(xì)胞系（SMMC-7721和HepG2）中AKT1的表達(dá)水平。按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書提取空白質(zhì)粒和AKT1-RNAi質(zhì)粒。提取出來(lái)的質(zhì)粒用

4、Effectene轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用PT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。Western blot用來(lái)檢測(cè)AKT1對(duì)分子蛋白調(diào)節(jié)機(jī)制的影響，MTT法檢測(cè)AKT1的表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)SMMC-7721和HepG2細(xì)胞的遷移能力。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　結(jié)果：與正常肝細(xì)胞系HL-7702中的表達(dá)水平相比，SMMC-7721和HepG2肝癌細(xì)胞系中 AKT1的表達(dá)明顯顯著上調(diào)（**P＜0.01）。

5、然后我們?cè)u(píng)估了下調(diào)質(zhì)粒（AKT1-RNAi質(zhì)粒）的轉(zhuǎn)染效率。相應(yīng)結(jié)果是下調(diào)質(zhì)粒抑制了AKT1的表達(dá)，表明轉(zhuǎn)染有效。進(jìn)行MTT測(cè)定以了解AKT1在HCC細(xì)胞增殖中的作用，結(jié)果顯示AKT1-RNAi質(zhì)粒下調(diào)AKT1的表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05）。AKT1-RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SMMC-7721和HepG2細(xì)胞的傷口愈合的能力明顯顯著降低（**P＜0.01）。此外，封閉AKT1后可通過抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活和下調(diào)MMP-2、MMP-9的

6、活性和表達(dá)來(lái)抑制HCC細(xì)胞系的增殖和遷移。（**P＜0.01）。在Western免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，與空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，敲除AKT1蛋白對(duì)NF-κB、MMP-2和MMP-9表達(dá)有明顯的影響。相于空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，AKT1-RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞MMP-2和MMP-9活性較低（**P＜0.01）。與此同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，在HCC細(xì)胞中下調(diào)AKT1抑制了其介導(dǎo)的NF-κB的表達(dá)和分泌（**P＜0.01）。
　　結(jié)論：我們的研究結(jié)果顯示AK