SSAT通過AKT-GSK-3β-β-catenin信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲.pdf

1、背景：肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全世界范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)的最常見的死亡原因之一。通常情況下，肝癌患者早期沒有明顯癥狀，被診斷時(shí)多已發(fā)展到晚期階段，已不適合手術(shù)治療。因此，晚期肝癌治療方法的選擇受到了極大的限制。此外，由于術(shù)后復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率較高，肝癌患者的五年存活率仍然不能令人滿意。因此，認(rèn)識(shí)肝癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制對(duì)肝癌的治療具有非常重要的指導(dǎo)意義。多胺是一類在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中含量豐富，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化

2、等生理過程且發(fā)揮關(guān)鍵作用的生物小分子，包括腐胺（Putrescine, PUT），亞精胺（Spermidine, SPD），以及精胺（Spermine, SPM）。已有大量文獻(xiàn)表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多胺的含量具有相關(guān)性。因此，多胺是一個(gè)十分有潛力的抗腫瘤靶點(diǎn)。精胺/亞精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶（Spermidine/spermine N1-acetyltransferase, SSAT）是真核細(xì)胞中多胺分解代謝的限速酶，是維持多胺濃度平衡的關(guān)鍵

3、酶。但是目前SSAT在肝癌中具體的生物學(xué)功能及作用機(jī)制仍然不清楚。
　　目的：以3種肝癌細(xì)胞（SMMC7721、Hep G2、Bel7402）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討SSAT對(duì)肝癌細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制。
　　方法：采用Western blotting實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)3種肝癌細(xì)胞SMMC7721、Hep G2和Bel7402中 SSAT蛋白的表達(dá)情況；采用轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建 SSAT穩(wěn)定高表達(dá)的 SMMC7721、Hep G2細(xì)胞株，以

4、及SSAT敲減的Bel7402細(xì)胞株；使用高效液相色譜法檢測(cè)SSAT對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)多胺含量的影響；使用 MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè) SSAT對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響；使用傷口愈合實(shí)驗(yàn)和鋪有Matrigel的Chamber transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SSAT對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響；使用Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AKT/GSK-3β/β-catenin通路蛋白的變化；使用高效液相色譜法檢測(cè)外加多胺對(duì)肝癌細(xì)胞

5、中多胺含量的改變，并使用Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外加多胺是否影響AKT/GSK-3β/β-catenin通路蛋白的變化；LiCl抑制 GSK-3β后，使用鋪有 Matrigel的Chamber transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并使用Western blotting檢測(cè)β-catenin及下游蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：⑴Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SMMC7721、Hep G2中

6、SSAT表達(dá)含量較低，而Bel7402中較高。在此基礎(chǔ)上我們轉(zhuǎn)染并使用Western blotting驗(yàn)證，成功構(gòu)建了SSAT高表達(dá)的SMMC7721、Hep G2細(xì)胞株，以及SSAT敲減的Bel7402細(xì)胞株。HPLC實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) SSAT高表達(dá)可以顯著下調(diào)肝癌細(xì)胞中多胺的含量。而 SSAT敲減后，多胺含量上升；⑵MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) SSAT可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力；⑶傷口愈合實(shí)驗(yàn)和鋪有Matrigel的Chambe

7、r transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SSAT可以抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；⑷Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSAT表達(dá)增加，AKT表達(dá)降低，且磷酸化減少。GSK-3β磷酸化也降低。而 SSAT表達(dá)下降，結(jié)果相反；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) SSAT高表達(dá)，β-catenin、Cyclin D1、以及N-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，而E-cadherin上調(diào)；⑸外源性多胺作用后，SSAT高表達(dá)的SMMC7721、Hep G2細(xì)胞中多胺含

8、量上升，基本與未轉(zhuǎn)染SSAT的空白對(duì)照中多胺含量相當(dāng)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明AKT、GSK-3β以及β-catenin蛋白水平出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)；⑹GSK-3β抑制劑 LiCl作用后，SSAT對(duì)細(xì)胞的抑制侵襲作用明顯降低。Western blotting的結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-catenin的蛋白水平隨著 p-GSK-3β的升高而上調(diào)。
　　結(jié)論：SSAT通過降低肝癌細(xì)胞中的多胺含量，經(jīng)由 AKT/GSK-3β/β-cateni