Klotho高表達抑制肝癌進展并通過下調(diào)Wnt-β-catenin信號傳導通路誘導肝癌細胞凋亡.pdf

1、研究背景:肝癌是常見的惡性腫瘤之一，在目前已知所有癌癥中，死亡率排在第三位。原發(fā)性肝癌主要包括兩種病理類型:肝細胞肝癌和膽管細胞型肝癌。肝癌不僅給患者帶來病痛及心理的負擔，同時也給患者家庭和社會帶來嚴重的經(jīng)濟壓力，因此肝癌已經(jīng)成為目前醫(yī)學研究的熱點。
　　Kuro-o等發(fā)現(xiàn)Klotho基因缺陷小鼠可出現(xiàn)多種衰老癥狀，而Klotho的超表達則可延長小鼠的壽命。Klotho基因位于人的染色體13q12區(qū)域，大小為50kb。它編碼單次跨

2、膜蛋白，其由胞外結(jié)構(gòu)域、單個跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域非常短并且沒有明確的功能。膜型Klotho蛋白作為成纖維細胞生長因子23(FGF23)的專屬受體可調(diào)節(jié)磷酸鹽穩(wěn)態(tài);細胞外結(jié)構(gòu)域（分泌型Klotho）可被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，起到循環(huán)激素的作用，調(diào)節(jié)氧化應激及多種生長因子受體和離子通道。Klotho在乳腺癌進展中的抗腫瘤作用在2008年首次被認定，最近數(shù)年，已經(jīng)有很多文獻研究探尋Klotho基因的表達與癌癥進展之間的關(guān)系，然

3、而該基因在癌癥中的作用機制尚未明確。研究表明Klotho的表達在幾種實體瘤中廣泛下調(diào)，包括子宮頸癌，胰腺癌，黑素瘤和消化道腫瘤，其也參與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病機制。在這些惡性腫瘤中，Klotho被闡明是幾種信號通路的調(diào)節(jié)劑，包括FGF信號傳導，胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)和Wnt途徑， Lu等對189個卵巢上皮癌患者進行了臨床隨訪，結(jié)果顯示分泌型Klotho基因的高表達與癌癥的進展、癌癥患者的死亡及IGF-Ⅰ和IGFBP-3

4、的表達呈負相關(guān)。在Wang等的報道中提到，作為一種新的抑癌基因，Klotho在胃癌中通過甲基化逐漸被滅活，對甲基化的Klotho蛋白的檢測可以用來預測胃癌患者的預后。在結(jié)腸癌患者中，Klotho基因的下調(diào)與癌癥的侵襲性及Dukes分期有關(guān)，而Klotho基因的超表達則可通過IGF1R介導的PI3K/AKT信號途徑來抑制結(jié)腸癌細胞的增殖及侵襲。另外，Klotho可以抑制宮頸癌細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲能力，在宮頸癌的體外模型中Klotho的表達通過

5、上調(diào)E-鈣粘蛋白和下調(diào)N-鈣粘蛋白及減少MMP-7和MMP-9的表達來降低癌癥細胞的游走及侵襲能力。Zhou等的研究表明，Klotho能有效抑制大B淋巴細胞瘤腫瘤細胞的生長，Klotho的超表達能顯著抑制大B細胞淋巴瘤中腫瘤細胞的增殖和誘導細胞凋亡，他們還發(fā)現(xiàn)在大B細胞淋巴瘤腫瘤細胞中阿霉素與重組人Klotho蛋白聯(lián)合使用能增強它們抗腫瘤的功效，研究表明，通過轉(zhuǎn)染Klotho載體途徑實現(xiàn)的Klotho的高表達可顯著抑制大B細胞淋巴瘤的移

6、植物模型的腫瘤細胞生長。
　　研究表明一些炎癥因子可下調(diào)Klotho水平，同時Klotho也可反過來調(diào)節(jié)、抑制一些炎癥因子（如TNF-α）的作用。在這方面，Wnt/β-catenin信號通路的異?；罨诟伟┑陌l(fā)病機理中具有關(guān)鍵作用。據(jù)報道分泌型Klotho蛋白通過結(jié)合Wnt配體來阻止Wnt結(jié)合其同源細胞表面受體而達到抑制Wnt信號的作用。隨著肝功能的衰竭，Klotho作為Wnt拮抗劑來誘導Klotho基因突變增強Wnt信號傳導通路

7、。
　　然而，Klotho基因與原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系現(xiàn)在仍未闡明，探索肝癌的進展中Klotho基因的作用及可能的機制對肝癌的基礎研究具有重要意義，我們期待明確其功能及其作用機制以便為肝癌患者的生物治療提供治療靶點。
　　目的:1.通過運用MTT試驗，逆轉(zhuǎn)錄PCR，克隆形成實驗，流式細胞分析及免疫印跡分析法等方法檢測分析Klotho超表達對肝癌細胞增殖和凋亡的影響。
　　2.探討Klotho表達和Wnt/β-cat

8、enin信號轉(zhuǎn)導通路之間關(guān)系。
　　方法:1.通過MTT試驗檢測肝癌細胞的增殖。將肝癌細胞HepG2和SMMC-7721細胞接種在48孔板中，將細胞培養(yǎng)8個小時，將pCMV6-Klotho和p CMV-6載體轉(zhuǎn)染載入細胞中繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72和96小時。最后，將MTT試劑加入培養(yǎng)液中，這種藍紫色結(jié)晶就會溶解在DMSO中。將這種溶解液倒置在96孔板中，檢測490nm和570nm之間波長的各孔的吸光值。
　　2.應用逆轉(zhuǎn)錄P

9、CR檢測肝癌細胞中Klotho mRNA的含量，使用RNA提純試劑盒用來提純所有的RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶Super-ScriptⅢ轉(zhuǎn)錄cDNA。原始序列式是:GAPDH,5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'和5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'和Klotho蛋白，5'-ACCTGG-TGGCGCACAACC-3'和5-TTGGCAAACCAACCTAGTACA-3' Klotho的PCR反應是在94℃中進行5分鐘，

10、然后在94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒共30個循環(huán)。最后，在72℃中進行10分鐘。GAPDH的反應條件與Klotho相似，但退火溫度為55℃30秒。
　　3.在肝癌細胞中轉(zhuǎn)入pCMV6-Klotho載體，在穩(wěn)定細胞系中轉(zhuǎn)入pCMV-6細胞系。在克隆形成試驗中，將細胞培養(yǎng)在6孔板中。在8小時后，將Klotho及對照組的載體轉(zhuǎn)染載入對應的細胞中，培養(yǎng)14天。培養(yǎng)液每3天更換一次。用甲醇來固定這些集落。用1.25％的龍膽紫著色，

11、然后在高倍鏡下計數(shù)。
　　4.流式檢測分析用來測定肝癌細胞的凋亡，根據(jù)試劑盒說明書，利用Ⅴ-FITC/PI膜連蛋白雙染色。將轉(zhuǎn)染pCMV6-Klotho和pCMV6載體的肝癌細胞在6孔板中培養(yǎng)48小時。將細胞用冰PBS培養(yǎng)液清洗3次，然后懸浮于HEPES-NaOH10 mM pH7.4，25 mM CaCl2和144 mM NaCl的混合培養(yǎng)液中。最后，在黑暗環(huán)境中冰上用AnnexinⅤ和PI進行染色30分鐘，然后將這些細胞進行流

12、式細胞分析。
　　5.通過免疫印跡分析法檢測Klotho，β-catenin，C-myc和CyclinD1的表達，將肝癌細胞轉(zhuǎn)移在48孔板中，培養(yǎng)8小時至它們粘連在一起。將細胞轉(zhuǎn)入pCMV6-Klotho和p CMV-6載體48小時。轉(zhuǎn)入pCMV6載體的細胞作為對組。實驗組是轉(zhuǎn)入rKlotho或者BSA（濃度為250 ng/mL）的細胞。BSA作為負向的對照組。然后將細胞用冰水PBS沖洗，用細胞裂解液做電泳分析。
　　結(jié)果:

13、1.在肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)Klotho低水平表達，用逆轉(zhuǎn)錄PCR和免疫印記分析法測定四種肝癌細胞中內(nèi)源性Klotho水平并與永生型的LO2肝細胞相比，檢測到Bel-7404和HepG2，SMMC-7721等肝癌細胞中的mRNA和蛋白質(zhì)含量更低。
　　2.轉(zhuǎn)染pCMV6-Klotho載體的HepG2和SMMC-7721肝癌細胞培養(yǎng)24，48，72，96小時，在OD490nm可見轉(zhuǎn)入p CMV6-Klotho的細胞數(shù)要比轉(zhuǎn)入p CMV6載體

14、的細胞數(shù)低，Klotho超表達明顯的抑制了細胞的增殖能力。將重組Klotho轉(zhuǎn)入SMMC-7721細胞和HepG2細胞中培養(yǎng)24，48，72，96小時后，可見重組Klotho可明顯抑制肝癌細胞系HepG2的SMMC-7721增殖，更高含量的klotho具有更明顯抑制肝癌細胞增殖的作用。Klotho的超表達及重組的Klotho均具有抑制肝癌細胞增殖的作用。
　　3.克隆形成試驗顯示Klotho基因表達抑制肝癌細胞的增殖，將對照載體(

15、pCMV6)和pCMV6-Klotho轉(zhuǎn)入肝癌細胞HepG2和SMMC-7721中，培養(yǎng)10天后可見轉(zhuǎn)入pCMV Klotho的肝癌細胞克隆數(shù)要比轉(zhuǎn)入對照組載體的數(shù)目明顯減少。Klotho的表達抑制肝癌細胞的增殖，Klotho作為一個潛在的腫瘤抑制因子具有重要的腫瘤抑制作用。
　　4.用流式細胞分析（PI和AnnexinⅤ-FITC雙染色）鑒定Klotho的超表達對肝癌細胞凋亡的影響。轉(zhuǎn)染pCMV6-Klotho載體的HepG2細

16、胞系的凋亡率比對照組明顯增高(P＜0.01)，與做同樣處理的SMMC-7721細胞系結(jié)果一致，表明Klotho蛋白可誘導肝癌細胞的凋亡。
　　5.在肝癌細胞中Wnt/β-catenin的信號轉(zhuǎn)導途徑存在異常。在肝癌細胞HepG2中轉(zhuǎn)染p CMV6-Klotho和對照組載體pCMV6，用免疫印跡分析法測定Klotho，β-catenin，C-myc和Cyclin D1的表達水平。在轉(zhuǎn)染pCMV6-Klotho的肝癌細胞HepG2中K

17、lotho的表達水平更高，而β-catenin，C-myc和Cyclin D1的表達水平更低。這與肝癌細胞HepG2中轉(zhuǎn)入Klotho并培養(yǎng)48小時后的結(jié)果一致。Klotho的高表達同時伴有β-catenin，C-myc和Cyclin D1的低表達。表明在HepG2細胞中Klotho的表達水平與Wnt/β-catenin的信號轉(zhuǎn)導通路呈負相關(guān)。
　　6.Klotho的超表達可降低內(nèi)源性β-catenin的含量和抑制細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，

18、β-catenin轉(zhuǎn)錄進入細胞核激活Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導途徑。在pCMV-Klotho轉(zhuǎn)錄的HepG2細胞中，β-catenin的含量與對照組相比在細胞質(zhì)中明顯增高。在pCMV6-Klotho轉(zhuǎn)染的細胞中，β-catenin在細胞質(zhì)及細胞核中均明顯的降低，C-myc和Cyclin D1的表達水平也降低。所有數(shù)據(jù)表明，Klotho的超表達減少了β-catenin的內(nèi)源性表達，也抑制了β-catenin從細胞質(zhì)經(jīng)載體載入細胞核