2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:環(huán)氧酶-2(COX-2)在肝細(xì)胞癌發(fā)病中的作用近年來逐漸被認(rèn)識,COX-2可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制凋亡,增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力,促進(jìn)腫瘤血管生成等多方面的作用參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展。目前多認(rèn)為COX-2的作用是通過前列腺素E2(PGE2)產(chǎn)生的,后者與胞膜EP受體結(jié)合后發(fā)揮促腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用,但具體的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不清楚。
   Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路在調(diào)控細(xì)胞的生長、運(yùn)動和分化,以

2、及在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用,已被確認(rèn)是與腫瘤相關(guān)的一個關(guān)鍵性信號通路。近年來的研究發(fā)現(xiàn)在30%~40%的肝細(xì)胞癌細(xì)胞中存在β-catenin的高表達(dá)和核內(nèi)聚集,Wnt/β-catenin信號通路在肝癌細(xì)胞中被激活。本課題擬研究COX-2和PGE2對人肝細(xì)胞癌Hep3B細(xì)胞增殖以及細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用,試圖闡明COX-2促肝癌生長的分子機(jī)制。
   方法:一、采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈

3、反應(yīng)(RT-PCR)檢測人肝細(xì)胞癌Hep3B細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞系QSG7701細(xì)胞內(nèi)COX-2mRNA和PGE2 EP受體mRNA的表達(dá),CCK-8細(xì)胞計數(shù)法檢測PGE2、特異性的EP2受體激動劑布他前列素(butaprost)、EP3/EP4受體激動劑乙醇前列腺素E1(PGE1 alcohol)以及選擇性的COX-2抑制劑尼美舒利對細(xì)胞增殖活性的影響,并觀察PGE2對尼美舒利作用的影響,確定藥物作用的量效和時效關(guān)系。
   二

4、、用陽離子脂質(zhì)體對Hep3B細(xì)胞進(jìn)行COX-2 siRNA(small interferingRNA)的轉(zhuǎn)染,RT-PCR檢測COX-2 mRNA表達(dá)水平的變化,CCK-8細(xì)胞計數(shù)法檢測COX-2基因表達(dá)下調(diào)后對細(xì)胞增殖活性的影響。
   三、設(shè)計靶向COX-2基因的RNA干擾序列,構(gòu)建作用于COX-2 mRNA的發(fā)卡狀RNA(COX-2 shRNA)的表達(dá)載體,進(jìn)行Hep3B細(xì)胞轉(zhuǎn)染,并篩選穩(wěn)定表達(dá)COX-2 shRNA的細(xì)胞

5、。采用RT-PCR檢測COX-2 mRNA表達(dá)水平的變化,CCK-8法考察COX-2 shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞后對細(xì)胞增殖的影響。
   四、將用以檢測β-catenin/TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性的熒光素酶報告質(zhì)粒TOPflash和FOPflash轉(zhuǎn)染肝癌Hep3B細(xì)胞,使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分別測定PGE2、butaprost、尼美舒利和COX-2shRNA對細(xì)胞內(nèi)熒光素酶轉(zhuǎn)錄活性的影響,以確定PGE2和COX-2是

6、否影響β-catenin/TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性。對Hep3B細(xì)胞進(jìn)行β-catenin siRNA的轉(zhuǎn)染,檢測β-catenin基因表達(dá)下調(diào)后對PGE2促細(xì)胞增殖作用的影響,闡明Wnt/β-catenin信號通路是否與PGE2的促生長效應(yīng)相關(guān)。
   五、采用免疫印跡技術(shù)分別檢測PGE2和COX-2shRNA對肝癌Hep3B細(xì)胞內(nèi)β-catenin和磷酸化β-catenin(Ser33/37/Thr41)的影響,探討PGE2

7、和COX-2對β-catenin的作用。采用免疫印跡技術(shù)檢測PGE2刺激Hep3B細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、磷酸化的GSK-3β(Ser9)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化Akt(Thr308)蛋白水平的變化,并觀察磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)抑制劑沃曼青霉素(wortmannin,WM)預(yù)處理Hep3B細(xì)胞后再給予PGE2刺激,細(xì)胞內(nèi)Akt、GSK-3

8、β磷酸化水平和β-catenin/TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性的變化,探討PGE2是否通過PI3K-Akt途徑對GSK-3β磷酸化后激活Wnt/β-catenin信號通路。
   結(jié)論:PGE2和EP2受體激動劑促進(jìn)表達(dá)COX-2和EP受體的肝細(xì)胞癌Hep3B細(xì)胞的增殖,而COX-2抑制劑和COX-2基因下調(diào)均能抑制Hep3B細(xì)胞的增殖,表明COX-2和其催化生成的PGE2具有促進(jìn)肝細(xì)胞癌生長的作用,此作用可能通過細(xì)胞膜上的EP2受體

9、介導(dǎo)。PGE2抑制Hep3B細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的磷酸化,增加Hep3B細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白含量,增強(qiáng)β-catenin/TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性:EP2受體激動劑butaprost顯著增強(qiáng)β-catenin/TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性,作用與PGE2類似;COX-2基因表達(dá)下調(diào)促進(jìn)Hep3B細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的磷酸化,降低Hep3B細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白水平,抑制β-catenin/TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活

10、性;COX-2抑制劑尼美舒利顯著抑制β-catenin/TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性,此作用可被PGE2削弱;β-catenin基因下調(diào)顯著抑制PGE2的促增殖作用。上述結(jié)果表明COX-2和其催化生成的PGE2通過抑制細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的磷酸化和降解,增強(qiáng)β-catenin/TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性,產(chǎn)生促進(jìn)Hep3B細(xì)胞增殖的作用。PGE2促進(jìn)Hep3B細(xì)胞Akt和GSK-3β的磷酸化,此作用可被PI3K特異性的抑制劑WM所阻斷

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