前列腺素E-,2-對(duì)膽管上皮癌HuCCT1和CCLP細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制.pdf

1、環(huán)加氧酶-2(COX-2)及其產(chǎn)物前列腺素E<,2>(PGE<,2>)在細(xì)胞增殖中的作用一直受到人們的關(guān)注，在許多腫瘤組織中都有COX-2/PGE<,2>的高表達(dá)現(xiàn)象，但PGE<,2>影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)理目前還不十分清楚。PGE<,2>是COX-2的主要產(chǎn)物，通過(guò)刺激誘導(dǎo)腫瘤血管增生，抑制局部免疫功能，調(diào)節(jié)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑而影響細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此研究PGE<,2>的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及PGE<,2>影響腫瘤細(xì)胞

2、生長(zhǎng)的機(jī)制可為防治腫瘤提供重要的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)探討PGE<,2>對(duì)膽管上皮癌細(xì)胞HuCCT1和CCLP增殖的影響，并初步探討了PGE<,2>促進(jìn)膽管上皮癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，為進(jìn)一步研究PGE<,2>影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。 研究目的：探討前列腺素E<,2>(prostaglandin E<,2>，PGE<,2>)對(duì)膽管上皮癌細(xì)胞HuCCT1和CCLP增殖的影響及其可能機(jī)制。 研究方法：1.細(xì)胞培養(yǎng)：HuCCT1

3、和CCLP膽管上皮癌細(xì)胞分別培養(yǎng)于DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)基中。2.細(xì)胞生長(zhǎng)和活性測(cè)定(WST-1)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGE<,2>對(duì)膽管上皮癌細(xì)胞增殖的影響。3.Fluo-3/AM熒光負(fù)載膽管上皮癌細(xì)胞，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)外源PGE<,2>對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。4.酶聯(lián)免疫法測(cè)定膽管上皮癌細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的濃度。5.PGE<,2>、forskolin和B

4、APTA-AM處理膽管上皮癌細(xì)胞，并制作細(xì)胞爬片，進(jìn)行熒光免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)，于熒光顯微鏡下觀察p-CREB的表達(dá)和定位。6.PGE<,2>、forskolin和BAPTA-AM處理膽管上皮癌細(xì)胞，提取蛋白，Western Blot檢測(cè)膽管上皮癌細(xì)胞中p-CREB蛋白的表達(dá)情況。7.收集江蘇省人民醫(yī)院膽管癌6例，免疫組化法檢測(cè)膽管癌組織中p-CREB蛋白的表達(dá)情況。 研究結(jié)果：1.細(xì)胞生長(zhǎng)和活性測(cè)定(WST-1)實(shí)驗(yàn)顯示1μmol

5、/L、5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L PGE<,2>可促進(jìn)膽管上皮癌細(xì)胞HuCCT1生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)率分別為105.36％、112.45％、120.73％和128.21％，CCLP細(xì)胞結(jié)果與此類似。2.10μmol/L PGE<,2>可引起HuCCT1細(xì)胞熒光值發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，熒光值平均增加約50％，表明PGE<,2>可增高HuCCT1細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，CCLP細(xì)胞結(jié)果與此類似。 3.PGE<,2>可增高HuCCT1

6、細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L PGE<,2>作用細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度分別為183.94pmol/L、189.01 pmol/L和202.12 pmol/L，CCLP細(xì)胞結(jié)果與此類似。4.熒光免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：p-CREB定位于HuCCT1和CCLP腫瘤細(xì)胞核，PGE<,2>和forskolin可以使CREB蛋白磷酸化水平增高，而BAPTA.AM則抑制CREB蛋白的磷酸化。5.We

7、stem Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果與熒光免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，PGE<,2>和forskolin可以使CREB蛋白磷酸化水平增高，而BAPTA-AM則抑制CREB蛋白的磷酸化。6.免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人膽管癌組織中有較強(qiáng)的p-CREB蛋白表達(dá)。 研究結(jié)論：膽管上皮癌細(xì)胞HuCCT1和CCLP經(jīng)PGE<,2>處理后可見細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>和cAMOP濃度增高、CREB蛋白的磷酸化水平增高。表明PGE<,2>可能通過(guò)Ca<'2+>、c