DKK1通過β-catenin-MMP7信號通路促進肝癌細胞遷移和侵襲.pdf

1、實驗背景:
　　肝細胞癌是最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)，其致死率在腫瘤相關疾病中排名第三位。近年來雖然早期診斷，以及放療、化療和手術治療的聯(lián)合使用使肝癌的治療有了一定的提高，然而，到目前為止，肝癌患者的預后仍然不容樂觀。最近有幾篇報道表明DKK1的高表達和肝癌的發(fā)展密切相關。然而，DKK1在肝癌中的生物學功能及其分子機制仍不清楚。
　　實驗目的:
　　本文以肝癌細胞和肝癌組織為研究對象，以期探討DKK1在肝癌中的

2、生物學功能及其潛在的作用機制。
　　實驗方法:
　　采用RT-PCR和Western blotting實驗檢測正常肝細胞(QSG-7701)和四種肝癌細胞(Hep G2，SMMC-7721，HuH-7和BEL-7402)中DKK1 mRNA和蛋白的表達。采用免疫組化法檢測肝癌組織中DKK1和β-catenin的表達。采用MTT和克隆形成實驗檢測DKK1對肝癌細胞增殖的影響。采用劃痕和Transwell實驗檢測細胞的侵襲和遷移

3、能力。使用GSK3β抑制劑LiCl和β-catenin抑制劑IWP-2來進一步確認β-catenin在DKK1誘導的肝癌細胞侵襲和遷移中的作用。應用RT-PCR檢測肝癌細胞中β-catenin，MMP7，以及LRP6 mRNA的表達，采用Western blotting檢測β-catenin，MMP7，LRP6，GSK3β和c-Myc等蛋白的表達。
　　實驗結果:
　　1、與正常的肝細胞QSG-7701相比，DKK1的mRN

4、A和蛋白水平在肝癌細胞系HuH-7，SMMC-7721和BEL-7402中明顯高表達。值得注意的是:DKK1的mRNA和蛋白水平在BEL-7402細胞中表達最高，在Hep G2細胞中表達最低。
　　2、當DKK1表達上調或者下調，肝癌細胞的增殖率并不改變。克隆形成實驗結果顯示:DKK1表達上調或者下調時只能微弱的增加或減少克隆數(shù)目，但與對照組相比并沒有顯著性差異。
　　3、DKK1高表達能明顯促進肝癌細胞的傷口愈合率，反之，

5、當DKK1低表達時能顯著降低肝癌細胞的傷口愈合率。Transwell實驗結果顯示:與對照組相比，DKK1穩(wěn)定高表達的細胞表現(xiàn)出更高的侵襲和遷移率;穩(wěn)定轉染DKK1 shRNA的肝癌細胞表現(xiàn)出更低的侵襲和遷移能力。與這些結果相一致的是，與健側正常的肝組織相比，DKK1在肝癌組織中明顯高表達;而且，與非轉移性的肝癌組織相比較，DKK1在轉移性的肝癌組織中表達更高。
　　4、免疫組化結果表明:在肝癌組織中，DKK1的表達和β-caten

6、in表達成正相關。而且，DKK1表達上調不僅能明顯促進Hep G2細胞中β-catenin的mRNA和蛋白水平，而且能明顯增加Hep G2細胞中β-catenin在細胞漿/細胞核的累積，以及增強具有野生型TCF結合位點的熒光素酶活性。反之，DKK1表達下調能明顯減少BEL-7402細胞中β-catenin的mRNA和蛋白表達，以及降低具有野生型TCF結合位點的熒光素酶活性。
　　5、使用β-catenin抑制劑IWP-2處理后，D

7、KK1誘導的肝癌細胞的侵襲和遷移被明顯降低。在穩(wěn)定轉染DKK1 shRNA的肝癌細胞中，上調β-catenin的表達能部分恢復DKK1 shRNA對β-catenin的轉錄和肝癌細胞的侵襲的抑制作用。同樣，當使用GSK3β抑制劑LiCl處理后，DKK1 shRNA對肝癌細胞的侵襲和遷移能力的抑制作用也被顯著地解除。
　　6、RT-PCR結果表明:盡管DKK1表達上調或者下調能顯著改變β-catenin的mRNA水平，但并不影響LR

8、P6細胞內(nèi)域和細胞外域的轉錄。Western blotting結果同樣表明:DKK1表達上調或下調不會影響LRP6細胞內(nèi)域和GSK3β的蛋白表達。然而，DKK1表達上調或者下調能明顯增加或者減少β-catenin和其下游靶點c-Myc的蛋白表達水平。進一步研究發(fā)現(xiàn):β-catenin抑制劑IWP-2能明顯抑制β-catenin的蛋白表達，而在穩(wěn)定轉染DKK1 shRNA的肝癌BEL-7402細胞中，GSK3β抑制劑LiCl能部分恢復DK

9、K1 shRNA對β-catenin的蛋白表達的抑制作用。
　　7、DKK1表達上調能顯著增加Hep G2細胞中β-catenin的mRNA和蛋白水平，反之，當用shRNA沉默DKK1后，肝癌細胞BEL-7402中β-catenin的mRNA和蛋白水平顯著地降低。而且，β-catenin抑制劑IWP-2能夠劑量依賴性的降低肝癌細胞中MMP7蛋白的表達。與對照組相比，轉染MMP7質粒的Hep G2細胞表現(xiàn)出更高的侵襲力。
　　

10、實驗結論:
　　1、DKK1在肝癌細胞中是高表達的。
　　2、DKK1對肝癌細胞的增殖沒有影響。
　　3、DKK1顯著促進肝癌細胞的遷移和侵襲，而且，DKK1在肝癌組織中明顯高表達;此外，與非轉移性的肝癌組織相比較，DKK1在轉移性的腫瘤組織中表達更高。
　　4、利用功能獲得和功能喪失實驗，我們證實DKK1是通過一種非經(jīng)典的Wnt信號通路來促進肝癌細胞中β-catenin的表達，繼而誘導肝癌細胞的遷移和侵襲。