靶向COX-2，AKT1和PI3Kp85基因的RNAi抑制胃腺癌SGC7901細胞侵襲遷移的體外實驗研究.pdf

1、目的:構建針對腫瘤相關基因AKT1、COX-2和PI3Kp85基因的shRNA重組腺病毒質粒表達載體,檢測其在胃腺癌細胞株SGC-7901中對.AKT1、COX-2和P13Kp85基因表達的抑制作用,以及敲低靶基因的表達后,觀察MMP-2、MMP-9、TIMP-2和VEGF的表達變化。在體外實驗中檢測腫瘤細胞侵襲和遷移活性的變化,并進一步探討COX-2和P13K/AKT信號通路在胃腺癌侵襲遷移過程中的作用機制。
　　 方法:本課

2、題分兩部分進行:
　　 第一部分:設計可形成小干擾RNA的AKT1、COX-2和PI3Kp85shRNA對應模板DNA序列,克隆至線性化質粒PEGFP6-1、PGENESIL-2、PEGFP6-4上,構建一個編碼AKT1、COX-2和PI3Kp85三條shRNA的質粒表達載體。將此質粒亞克隆至腺病毒表達載體上,經酶切、測序鑒定正確后包裝擴增并鑒定其病毒滴度,然后轉染至SGC7901細胞中檢測其轉染率。
　　 第二部分:在

3、體外應用RNA干涉技術,以構建的重組腺病毒介導靶向AKT1、COX-2和PI3Kp85的shRNA轉染人胃腺癌細胞系SGC-7901后,應用RealtimePCR和Westernblot法檢測目的基因的敲低情況,并用Westernblot法檢測RNAi敲低靶基因的表達后,COX-2及EGFR通路下游侵襲相關因子MMP-2、MMP-9、TIMP-2和VEGF的蛋白表達變化。應用ELISA檢測轉染前后分泌到細胞外的MM9-2和MMP-9的濃

4、度變化。應用劃痕實驗、Transwell實驗、2-D和3-D的Matrigel基質生長實驗評價腫瘤細胞轉染前后侵襲遷移能力的變化。
　　 結果:
　　 1.通過應用定向克隆、同源重組等技術,獲得一種同時包含靶向COX-2、PI3Kp85和AKT1三條RNA干擾序列的真核表達質粒,經酶切分析,測序鑒定表明構建成功后,擴增并亞克隆至重組腺病毒載體上,獲得重組腺病毒質粒表達載體rAd5-C-A-P。由于重組腺病毒質粒表達載體上

5、帶有熒光蛋白表達框,所以通過轉染SGC-7901后觀察熒光蛋白表達情況,計算轉染率>90％。
　　 2.RealtimePCR和Westernblot結果提示,轉染AKT1、COX-2和PI3Kp85shRNA后可明顯敲低靶基因mRNA和蛋白的表達。在靶基因被下調后通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)COX-2及PI3K/AKT信號通路下游侵襲相關因子MMP-2、MMP-9和VEGF的表達水平均明顯降低,而TIMP-2表達上調。應

6、用ELASA檢測發(fā)現(xiàn)rAd5-C-A-P轉染組細胞培養(yǎng)液中MMP-2和MMP-9明顯減低,劃痕實驗顯示與對照組和無義序列組相比,rAd5-C-A-P轉染組細胞遷移運動能力明顯減弱,Transwell體外侵襲實驗結果顯示對照組和無義序列組穿過細胞數(shù)分別為(105±4)、(102.5±6.4),而rAd5-C-A-P轉染組(26.4±4.6)(p<0.001)。2-D的Matrigel基質生長實驗顯示對照組和無義序列組細胞呈正常形態(tài)貼壁生長

7、并融合成片,而rAd5-C-A-P轉染組細胞貼壁能力與遷移能力均明顯減低,3-D的Matrigel基質生長實驗顯示與對照組和無義序列組比較,rAd5-C-A-P轉染組細胞形成的細胞團塊較小(p<0.001)。
　　 結論:
　　 1.成功構建靶向AKT1、COX-2和PI3Kp85的重組腺病毒質粒表達載體,其能在體外高效轉染腫瘤細胞。
　　 2.靶向.AKT1、COX-2和PI3Kp85的RNA干擾技術可以序列特