腺病毒介導(dǎo)的靶向性Akt1和COX-2shRNA抑制SGC-7901人胃腺癌細胞生長的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的:研究腺病毒介導(dǎo)的靶向性蛋白激酶B1(PKB1/Akt1)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)短發(fā)夾RNA(shRNA)表達載體rAd5-Akt1+COX-2(rAd5-A+C)在體內(nèi)外對人胃腺癌細胞株SGC-7901生長的抑制效果和探討其可能的機制。
　　 方法:將腺病毒載體rAd5-A+C體外轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株SGC-7901后,熒光顯微鏡下觀察腺病毒rAd5-A+C的轉(zhuǎn)染效率,Real-time PCR和Western blot

2、分別檢測對照組SGC-7901、空載組rAd5-HK和治療組tAd5-A+C中Akt1和COX-2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達；同時利用Western blot進一步檢測各組腫瘤細胞核增殖相關(guān)抗原Ki-67、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管內(nèi)皮標志物CD31、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)及凋亡的抑制指標Bcl-2的蛋白表達水平；噻唑藍比色分析法(MTT法)和流式細胞法評價轉(zhuǎn)染后胃癌細胞的增殖活性。裸鼠皮下移植瘤模型進一步觀察rAd

3、5-A+C對胃腺癌SGC-7901生長的抑制效果,并應(yīng)用免疫組化檢測腫瘤相關(guān)蛋白Akt1、COX-2、Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1及Bcl-2的表達水平；TUNEL法檢測腫瘤組織細胞的原位凋亡。
　　 結(jié)果:將腺病毒rAd5-A+C體外轉(zhuǎn)染人胃腺癌細胞株SGC-790124h后,熒光顯微鏡下觀察到腺病毒rAd5-A+C有很高的轉(zhuǎn)染效率,可達90％以上。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示治療組rAd5-A+

4、C的Akt1和COX-2 mRNA表達明顯下調(diào),其ACt值分別是(12.26±0.05)和(5.41±0.09),比空載組rAd5-HK(10.63±0.02)、(3.75±0.08)和對照組SGC-7901(10.57±0.02)、(3.73±0.08)增高,而空載組和對照組之間ΔCt值無明顯變化。同時治療組的Akt1和COX-2蛋白表達量與空載組和對照組相比分別下調(diào)70.5％和63.7％,空載組和對照組相比Akt1和COX-2蛋白表

5、達差異無統(tǒng)計學(xué)意義；并且與胃癌生長相關(guān)的指標Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1及Bcl-2的蛋白表達水平也明顯下調(diào)。體外實驗MTT法顯示與對照組SGC-7901和空載組rAd5-HK相比較,治療組rAd5-A+C的胃癌細胞在治療24h后增殖活性明顯被抑制；而細胞周期分析顯示rAd5-A+C治療組進入S期的細胞數(shù)減少了13.4％和14.7％,而進入G0/G1期的細胞增加了18.3％和17.3％,細胞阻滯在G0/G1期。體內(nèi)裸

6、鼠皮下荷瘤模型顯示rAd5-A+C可抑制腫瘤的生長；免疫組化法檢測腫瘤標本的相關(guān)蛋白表達情況顯示,治療組rAd5-A+C的Akt1、COX-2、Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1及Bcl-2表達水平均有明顯下調(diào),且rAd5-A+C可誘導(dǎo)腫瘤組織細胞的原位凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1.介導(dǎo)靶向性Akt1和COX-2 shRNA的腺病毒載體rAd5-A+C轉(zhuǎn)染胃腺癌細胞株SGC-790124h后有很高的轉(zhuǎn)染效

7、率。
　　 2.在體外實驗中腺病毒載體rAd5-A+C轉(zhuǎn)染后可明顯敲低胃腺癌癌細胞SGC-7901中Aktl和COX-2的表達,并進而下調(diào)與胃腺癌細胞生長相關(guān)的指標Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1及Bcl-2的表達。腺病毒載體rAd5-A+C通過下調(diào)Akt1和COX-2的表達能明顯抑制胃腺癌細胞增殖和血管生成,阻滯細胞周期的進程及誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。
　　 3.裸鼠皮下移植瘤模型顯示:腺病毒載體rAd5-

8、A+C同樣能抑制胃腺癌組織中Akt1和COX-2的表達及下調(diào)與胃癌細胞生長相關(guān)指標Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1和Bcl-2的表達；腺病毒載體rAd5-A+C通過下調(diào)Akt1和COX-2的表達也能明顯抑制胃腺癌的生長和誘導(dǎo)胃腺癌組織細胞的凋亡,且與體外實驗結(jié)果一致；
　　 4.腺病毒載體rAd5-A+C通過下調(diào)Akt1和COX-2的表達來抑制胃腺癌細胞SGC-7901生長的機制可能與下調(diào)Ki-67、VEGF、C