sirna對(duì)胃腺癌細(xì)胞株sgc-7901血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的作用

1、<p>　　siRNA對(duì)胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的作用</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 RNA干擾;胃腫瘤;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類;基因表達(dá) </p><p>　?。壅菽康?研究siRNA對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因表達(dá)的影響。方法利用體外合成帶有T7啟動(dòng)子的VEGF基因DNA片段，轉(zhuǎn)錄針對(duì)VEGF mRNA的si

2、RNA，通過(guò)脂質(zhì)體2000將合成的siRNA轉(zhuǎn)染入SGC-7901細(xì)胞，設(shè)置轉(zhuǎn)染VEGF錯(cuò)義序列組、脂質(zhì)體組、空白對(duì)照組作為對(duì)照，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的改變，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后VEGF mRNA表達(dá)水平的變化，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF蛋白分泌量的變化。結(jié)果 所設(shè)計(jì)的兩個(gè)靶位點(diǎn)siRNA均能有效抑制胃腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并使細(xì)胞周期阻滯于G0 /G1 期;VEGF mRNA的表達(dá)也受到有效抑制，明顯

3、減少;同時(shí)，對(duì)應(yīng)的VEGF蛋白水平也顯著降低，作為陰性對(duì)照的錯(cuò)義序列組siRNA則沒有出現(xiàn)這種變化。結(jié)論 體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA可抑制胃腺癌SGC-7901細(xì)胞VEGF基因的表達(dá)。 </p><p>　?。坳P(guān)鍵詞］ RNA干擾;胃腫瘤;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類;基因表達(dá) </p><p>　　［ABSTRACT］ObjectiveTo evaluate the gene expression

4、of VEGF by RNA interference in human gastric cancer. Methods siRNAs targeting VEGF mRNA was obtained by in vitro transcription， which was transfected into human gastric cancer cell lines SGC-7901 with Lipofectamine 2000.

5、 The non-transfected cells， cells treated with Lipofectimine and cells treated with SCR were taken as controls. MTT was used to detect the inhibitive rate of cell growth. Flow cytometry was used to detect the changes of

6、cyc-ling </p><p>　?。跭EY WORDS］RNA interference; gastric neoplasms; vascular endothelial growth factor; gene expression </p><p>　　腫瘤血管的形成受多種因子的調(diào)節(jié)，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是作用最強(qiáng)、特異性最高的一種能刺激細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和腫瘤血管生成的因子，與

7、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。將外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA（dsRNA）導(dǎo)入細(xì)胞后引起與該段RNA同源的 mRNA產(chǎn)生特異性降解，其相應(yīng)的基因受到抑制，這種發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的基因靜寂現(xiàn)象被稱為RNA干擾（RNAi）［1～3］。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，21～23 bp的siRNA（small interference RNA）可特異性地發(fā)揮RNAi作用［4］。胃癌是我國(guó)最常見的消化道腫瘤， 其病死率居各種惡性腫瘤之首［5～7］。探索治療胃腺癌的新方法具有重

8、要臨床價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以VEGF基因?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)合成siRNA，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將其轉(zhuǎn)入胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901，研究其靜寂VEGF基因表達(dá)的效應(yīng)，為臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。 </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 材料及其來(lái)源 SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)協(xié)和基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心。DMEM培養(yǎng)基、Li

9、pofectamineTM2000、TRIzol Reagent、RPMI 1640購(gòu)自Invitrogen公司。T7 Ri-boMAXTMExpress RNAi System試劑盒、Access RT-PCR Introductory System購(gòu)自Promega公司。 四唑氮藍(lán)（MTT）購(gòu)自Sigma公司。人VEGF ELISA　Kit購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。 </p><p>　　1.2 siR

10、NA的制備 從GenBank中獲取已知的人VEGF mRNA序列（ACCESSION:AB021221）。依據(jù)Promega公司提供的設(shè)計(jì)軟件和試劑盒設(shè)計(jì)合成siRNA序列，見表1。 </p><p>　　表1 設(shè)計(jì)合成的siRNA序列（略） </p><p>　　1.3 細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)0.10新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.0

11、5 CO2 條件下培養(yǎng)。 </p><p>　　1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，配制6×107 /L濃度的細(xì)胞懸液，加到96孔板內(nèi)（Corning，美國(guó)），每孔加100 μL。設(shè)空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、錯(cuò)義序列組（錯(cuò)義序列組SCR序列與siRNA2 序列有相同的GC組成，但是和人的 mRNA沒有明顯的同源性，以此作為陰性對(duì)照［8］）、siRNA各劑量組，每組5孔，接種2

12、4 h后棄去上清，采用脂質(zhì)體包裹的方式轉(zhuǎn)染siRNA。siRNA1 和siRNA2 兩組分別設(shè)立4個(gè)濃度，分別為100、200、400、1 000 nmol/L，分別定義為低、中、高、極高劑量組;siRNASCR組只設(shè) 200 nmol/L ，加含各濃度的siRNA Opti-MEM培養(yǎng)基 100 μL ;脂質(zhì)體組只加脂質(zhì)體，空白對(duì)照組只加Opti-MEM培養(yǎng)基100 μL，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù) 0.05 CO2、無(wú)血清培養(yǎng)基中繼續(xù)

13、培養(yǎng)6 h，每孔補(bǔ)加新生牛血清10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)。脂質(zhì)體組Lipo-fectamineTM2000用量為每孔0.5 L，按Lipo-fectamineTM2000使用說(shuō)明書操作。于24 h后分別加入M</p><p>　　1.5 流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染siRNA后細(xì)胞的凋亡 各組細(xì)胞以1.5×105 /L密度接種于25 cm2 培養(yǎng)瓶，以1.4方法轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化離心收集并懸于PBS中，4

14、 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.70的乙醇固定30 min，用含RNase及碘化丙錠（PI）的染色液染色30 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀（EPICS-ELITE- ESP）進(jìn)行細(xì)胞周期分析，每個(gè)樣本約檢測(cè) 11 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算各期細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率。 </p><p>　　1.6 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)水平 各組細(xì)胞以1.0×105 /L密度接種于6孔板， 24 h后 棄去上清，加入si

15、RNA1 、siRNA2 、siRNASCR200 nmol/L，按1.4方法轉(zhuǎn)染24 h后胰酶消化，離心收集。TRIzol提取各組細(xì)胞總RNA，取1 g總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。VEGF引物:上游引物:5′-TCCGGGCCTCCGAAACC-3′，下游引物:5′-CCTGGTGAGATCTGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為421 bp;內(nèi)參照GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）引物:上游:5′-ACTGCCACCCAGAAGACT-3′，下

16、游:5′-GCT-CAGTGTAGCCCAGGAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為292 bp。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在20 g/L的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳觀察并照相，然后應(yīng)用天能分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行掃描，檢測(cè)各組VEGF mRNA與其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參 GAPDH mRNA RT-PCR產(chǎn)物的吸光度（ A ）值，計(jì)算 AVEGF/ AGAPDH的比值。 </p><p>　　1.7 VEGF蛋白分泌量分析 收取轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞上清用于檢測(cè)V

17、EGF蛋白分泌量。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作，將不同濃度的VEGF標(biāo)準(zhǔn)品（7.8、15.6、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 ng/L）以及不同組細(xì)胞上清液于Rayto 2100C酶標(biāo)儀中檢測(cè)450 nm吸光度（ A ）值。讀板后儀器自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出各待測(cè)樣本的VEGF含量。 </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p>&l

18、t;p>　　2.1siRNA對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制 siRNA1 、siRNA2 的低、中、高劑量組的吸光度值與空白對(duì)照組比較，差異均有極顯著意義（ F= 12.264 ，q=9.827～10.260，P &lt;0.01）;極高劑量組的吸光度值與脂質(zhì)體組比較差異有顯著意義（ q= 7.231 ，P &lt;0.05）。錯(cuò)義序列組、脂質(zhì)體組與正常對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性（ P &gt;0.05）。不

19、同劑量各組之間比較，中劑量組吸光度值最低，抑制率最高（ q= 10.198～ 10.260，P &lt;0.001）。見表2。 </p><p>　　2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)細(xì)胞周期的影響與空白對(duì)照組比較，siRNA作用的細(xì)胞G0 /G1 期（細(xì)胞靜止期和DNA合成前期）比例升高，S期（DNA合成期）比例降低;錯(cuò)義序列組、脂質(zhì)體組與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。見表3。 </p><

20、p>　　2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 siRNA 后各組 VEGF mRNA 表達(dá)水平 電泳結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、錯(cuò)義序列組421 bp處均見清晰條帶，siRNA各組條帶均明顯減弱（見圖1），各組內(nèi)參照GAPDH條帶一致?？瞻讓?duì)照組、脂質(zhì)體組、siRNASCR組、siRNA1 組、siRNA2 組 AVEGF/ AGAPDH比值分別為 0.856± 0.009 、 0.834±0.020 、 0.815±

21、0.017 、 0.456± 0.030 、 0.468± 0.019，siRNA1 、siRNA2 與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、錯(cuò)義序列組比較，差異均有極顯著意義（ F= 244.945 ，q=27.427～30.560，P &lt; 0.01 ），其他各組比較差異無(wú)顯著性。 </p><p>　　2.4siRNA轉(zhuǎn)染后24 h各組VEGF蛋白分泌量的變化 siRNA1 和siRNA2

22、組的VEGF蛋白分泌量明顯低于其他3組，差異均有顯著性（ F=33.131，q= 9.036～ 12.154，P &lt;0.01）。見表4。 </p><p>　　表2 轉(zhuǎn)染siRNA各組SGC-7901細(xì)胞24 h抑制率（略） </p><p>　　表3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化（略） </p><p>　　圖1 轉(zhuǎn)染siRNA后SGC-7901細(xì)胞V

23、EGF mRNA表達(dá)水平（略） </p><p>　?、?DNA Marker;② siRNA1 ;③ siRNA2 ;④ 脂質(zhì)體組 </p><p>　　表4 各組SGC-7901細(xì)胞上清VEGF蛋白分泌量的比較（略） </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　胃腺癌是人類常見的癌癥之一，

24、嚴(yán)重威脅人類的健康和生命，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。手術(shù)治療可以使其中一部分病人得到治愈，但更多的病人面臨錯(cuò)失手術(shù)時(shí)機(jī)以及術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的局面。在分子生物學(xué)迅速發(fā)展的今天，尋找一條有效的胃腺癌基因水平的治療方法具有重要的臨床價(jià)值。 微血管的生成與腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展與轉(zhuǎn)移密不可分，抑制血管生成已成為近年來(lái)抗腫瘤治療研究的重要課題和熱點(diǎn)問(wèn)題。腫瘤血管的形成受多種因子調(diào)節(jié)，其中最重要的一種是VEGF，它不僅促進(jìn)血管生成，還增加血管通透性，促進(jìn)轉(zhuǎn)移，

25、改變宿主免疫功能。VEGF基因位于染色體的6p21.3，全長(zhǎng) 28 kb ，編碼VEGF的基因長(zhǎng)約14 kb，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子交替構(gòu)成。其 mRNA的不同剪接可以產(chǎn)生5種異構(gòu)體，即VEGF121、145、165、189及206［9］。其中VEGF165是最為常見的形式，在包括胃腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中有表達(dá)［10，11］，在腫瘤微血管生成過(guò)程中扮演重要角色。通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)抑制腫瘤微血管形成是當(dāng)前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。RNAi

26、作為生命科學(xué)領(lǐng)域的新技術(shù)，其應(yīng)用非常廣泛，從單細(xì)胞生物一直到人，作為基因表達(dá)干預(yù)的理想方法，</p><p>　　本文實(shí)驗(yàn)所用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒所轉(zhuǎn)錄出來(lái)的 siRNA純度高 ，可直接應(yīng)用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合RNA形成RNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，同時(shí)又吸附在帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在短期應(yīng)用的基因治療中具有明顯優(yōu)點(diǎn)?？傊?，本文為RNAi應(yīng)用于腫瘤的基因治療提供了一些實(shí)驗(yàn)

27、基礎(chǔ)，驗(yàn)證了應(yīng)用RNA干擾技術(shù)可以有效抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制瘤細(xì)胞的增殖、防治腫瘤的基因治療思路，為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)然，針對(duì)VEGF的RNAi技術(shù)臨床應(yīng)用于胃腺癌治療尚需要進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 </p><p><b>　?。蹍⒖嘉墨I(xiàn)］ </b></p><p>　?。?］ FIRE A. RNA-triggered gene sil

28、encing［J］. TIG， 1999，15（9）:358-363. </p><p>　?。?］ FIRE A. Potent and genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans ［J］. Nature， 1998，391:806-811. </p><p>　　［3］ 項(xiàng) 鋒鋼，馬桂馨

29、. 肺癌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體Flt1及KDR的表達(dá)及其與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系［J］.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，40（1）:8-10. </p><p>　?。?］ 楊 光，曹國(guó)軍，李潔，等. SiRNA抑制SARS冠狀病毒感染Ve-ro E6 細(xì)胞［J］.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2004，1:270-273. </p><p>　?。?］ 吳 漢平，吳開春，李玲，等. 人環(huán)氧合酶-2

30、（hCOX-2）編碼基因的克隆及其反義核酸轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞的初步研究［J］.世界華人消化雜志，2000，8:1211-1217. </p><p>　?。?］ 鄧 大君， 鄂征. 胃癌病因:人N-亞硝酰胺暴露［J］.世界華人消化雜志，2000，8:250-252. </p><p>　?。?］ 薛 緒潮， 方國(guó)恩， 華積德. 胃癌與細(xì)胞凋亡［J］.世界華人消化雜志，1999，7:359-361

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32、?。?］ 楊 英. 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在腫瘤中的作用［J］ .國(guó)外醫(yī)學(xué):腫瘤學(xué)分冊(cè)，2004，12（31）:18-20. </p><p>　　［10］ KOLLERMANN J， HELPAP B. Expression of vascular endo-thelial growth factor and VEGF receptor Flk21 in benign， pre-malignant and malig

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