他克莫司及5-Fu對肝癌細(xì)胞株增殖及其血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響.pdf

1、研究目的：研究他克莫司(即FK506)及5-Fu對體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株增殖及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響，從而明確普樂可復(fù)對體內(nèi)除淋巴細(xì)胞外的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞的多種信號傳導(dǎo)機(jī)制是否存在影響。以期是否可以對肝癌患者肝移植術(shù)后，在抗排斥藥物及抗腫瘤藥物的作用下，體內(nèi)殘存腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性進(jìn)行判斷，進(jìn)而初步推測是否可以通過早期抑制殘存腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)，減少移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，改善肝癌患者移植術(shù)后遠(yuǎn)期預(yù)后。 研究

2、方法：在體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下，通過MTT方法檢測FK506及5-Fu對肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖的影響，ELISA方法檢測肝癌細(xì)胞株培養(yǎng)液上清VEGF的水平變化，半定量RT-PCR檢測各組肝癌細(xì)胞株VEGF的mRNA表達(dá)情況變化，Westernblotting免疫印跡法檢測肝癌細(xì)胞株VEGF蛋白的表達(dá)水平變化及VEGF蛋白的定量分析。并通過對肝癌裸鼠種植瘤質(zhì)量、體積以及小鼠血漿VEGF水平的分析，輔以種植瘤組織病理切片中VEGF表達(dá)

3、和微血管密度分析，研究普樂可復(fù)及氟尿嘧啶對肝癌細(xì)胞株SMMC-7721種植瘤增殖及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1、MTT法測定肝癌細(xì)胞增殖情況：與無藥物對照組相比，F(xiàn)K506組、5-Fu組及FK506+5-Fu組對培養(yǎng)72小時(shí)肝癌細(xì)胞均有不同程度的增殖抑制現(xiàn)象，F(xiàn)K506+5-Fu組增殖抑制現(xiàn)象較前三組明顯。對照組A450值為0.728±0.07，F(xiàn)K506組A450值為0.570±0.38，5-Fu組A4

4、50值為0.386±0.21，F(xiàn)KS06+5-Fu組A450值為0.242±0.47。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、ELISA方法檢測肝癌細(xì)胞株培養(yǎng)液上清VEGF的水平：與無藥物對照組相比，F(xiàn)K506組、5-Fu組及FK506+5-Fu組對培養(yǎng)24小時(shí)肝癌細(xì)胞上清液中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的水平均有不同程度降低，F(xiàn)K506+5-Fu降低程度較明顯。對照組VEGF濃度值為194.3pg/ml±5.53pg/ml，F(xiàn)K506

5、組VEGF濃度值為165.7pg/ml±6.32pg/ml，5-Fu組VEGF濃度值為144.3pg/ml±3.62pg/ml，F(xiàn)K506+5-Fu組VEGF濃度值為132.3pg/ml±4.56pg/ml。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3、RT-PCR檢測肝癌細(xì)胞株VEGF的mRNA表達(dá)情況：各組中肝癌細(xì)胞株VEGF-mRNA的表達(dá)以無藥對照組最多，較無藥對照組FK506組、5-Fu組、FK506+5-Fu組較少。各組檢

6、測物OD值與β-actin OD值的比值：對照組比值為1.60±0.187，F(xiàn)K506組比值為1.00±0.20，5-Fu組比值為0.58±0.08，F(xiàn)K506+5-Fu組比值為0.38±0.08。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、免疫印跡法檢測肝癌細(xì)胞株VEGF蛋白的表達(dá)水平：各組中肝癌細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)以無藥對照組最多，F(xiàn)K506組、5-Fu組、FK506+5-Fu組較少。各種檢測物OD值與β-actin OD值的

7、比值：對照組比值為1.38±0.084，F(xiàn)K506組比值為0.98±0.130，5-Fu組比值為0.60±0.087，F(xiàn)K506+5-Fu組比值為0.36±0.089。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5、肝癌細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)定量分析：對照組VEGF蛋白表達(dá)值為840.7pg/ml±54.36pg/ml，F(xiàn)K506組VEGF表達(dá)值為630.5pg/ml±36.84pg/ml，5-Fu組VEGF表達(dá)值為510.5pg/ml

8、±29.10pg/ml，F(xiàn)K506+5-Fu組VEGF表達(dá)值為341.5pg/ml±38.14pg/ml。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6、FK506及5-Fu對肝癌裸鼠移植瘤生長的影響：FK506對種植瘤生長無明顯抑制作用。5-Fu對種植瘤生長有明顯的抑制作用，F(xiàn)K506與5-Fu無明顯的協(xié)同作用。FK506對瘤組織VEGF表達(dá)無明顯抑制作用，5-Fu對VEGF表達(dá)存在明顯的抑制作用，F(xiàn)K506與5-Fu無明顯的協(xié)同作用

9、。FK506對瘤組織微血管形成無明顯抑制作用，5-Fu對瘤組織微血管形成存在明顯的抑制作用，F(xiàn)K506與5-Fu無明顯的協(xié)同作用。 電泳產(chǎn)物分析：與無藥物對照組相比，F(xiàn)K506組、5-Fu組及FK506+5-Fu組對培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的mRNA及蛋白表達(dá)均有不同程度的增殖抑制現(xiàn)象，F(xiàn)K506+5-Fu組增殖抑制現(xiàn)象明顯。 結(jié)論：普樂可復(fù)(5ug/L)對體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株SMMC7721的增殖及血管內(nèi)