阿瓦斯丁對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的：研究阿瓦斯丁對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖、細(xì)胞周期、凋亡的影響，觀察不同濃度阿瓦斯丁對(duì)HaCaT細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VEGFR-2)表達(dá)的影響，初步探討其可能的作用機(jī)制，為阿瓦斯丁治療銀屑病提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，同時(shí)為銀屑病的臨床治療提供新思路。
　　方法：以永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞作為銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞模型。采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度阿瓦斯丁作用HaCaT細(xì)胞24h、48h、

2、72h后對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖的抑制作用;半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)和Western blot方法測(cè)定不同濃度阿瓦斯丁對(duì)HaCaT細(xì)胞VEGF及VEGFR-2表達(dá)的影響;Hoechst33258熒光染色法觀察阿瓦斯丁誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)阿瓦斯丁對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化的影響。
　　結(jié)果：1.CCK-8法檢測(cè)結(jié)果表明不同濃度阿瓦斯丁作用HaCaT細(xì)胞24h、48h、72h后均

3、可抑制HaCaT細(xì)胞體外增殖，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。阿瓦斯丁作用48h后，對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖的抑制作用最強(qiáng)，50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml阿瓦斯丁組的體外增殖抑制率分別為14.7％、25.56％、34.22％、45.78％，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。隨著阿瓦斯丁濃度的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)（r=0.964，P＜0.05）。2.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明:

4、對(duì)照組、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml阿瓦斯丁組作用48h后，HaCaT細(xì)胞VEGF與β-actin熒光強(qiáng)度比值分別為:0.676±0.052、0.590±0.039、0.507±0.040、0.429±0.043，與對(duì)照組(0.769±0.032)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);VEGFR-2與β-actin熒光強(qiáng)度比值分別為:0.740±0.016、0.688±0.033、0.531±0.

5、031、0.465±0.026，與對(duì)照組(0.804±0.021)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;結(jié)果表明阿瓦斯丁可下調(diào)VEGF和VEGFR-2 mRNA的表達(dá)，且隨著阿瓦斯丁濃度的增加表達(dá)量逐漸降低。3.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:對(duì)照組、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml阿瓦斯丁組處理HaCaT細(xì)胞48h后，VEGF與β-actin灰度比值分別為:0.773±0.044、0.680±

6、0.06、0.596±0.052、0.497±0.033，與對(duì)照組(0.860±0.038)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;VEGFR-2與β-actin的灰度比值分別為:0.700±0.029、0.623±0.037、0.549±0.018、0.473±0.04，與對(duì)照組(0.778±0.062)相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;結(jié)果表明阿瓦斯丁能在蛋白水平下調(diào)VEGF和VEGFR-2的表達(dá)。4.Hoechst33258熒

7、光染色顯示阿瓦斯丁處理HaCaT細(xì)胞48h后，可見(jiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚、邊集、核裂解的形態(tài)學(xué)改變，而對(duì)照組未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變。5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml阿瓦斯丁組作用HaCaT細(xì)胞48h后，細(xì)胞凋亡率分別為:（0.43±0.040）％、（0.53±0.057）％、（1.23±0.085）％、（1.58±0.035）％，與對(duì)照組（0.22±0.026）％相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

8、P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示阿瓦斯丁能夠誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡，其中400μg/ml阿瓦斯丁組作用最強(qiáng)。6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果表明不同濃度阿瓦斯丁作用HaCaT細(xì)胞48h后均可增加G0/G1期細(xì)胞的比例，其中50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml阿瓦斯丁組G0/G1期的細(xì)胞比例分別為:（42.45±0.84）％、（48.92±1.58）％、（52.01±2.35）％、（55.07±1.76）％，與對(duì)

9、照組（38.97±1.21）％相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明阿瓦斯丁可有效阻滯HaCaT細(xì)胞的周期進(jìn)程，細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，尤以400μg/ml阿瓦斯丁組作用最強(qiáng)。
　　結(jié)論：1.阿瓦斯丁能夠抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞體外增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2.阿瓦斯丁作用HaCaT細(xì)胞后，可在mRNA和蛋白水平下調(diào)VEGF和VEGFR-2的表達(dá)。3.阿瓦斯丁可有效阻滯HaCaT細(xì)胞的周期進(jìn)程，細(xì)胞周期被阻滯在G0