血管內皮生長因子對水牛卵母細胞體外成熟的影響.pdf

1、目前，卵母細胞體外成熟培養(yǎng)技術已取得很大進展，但體外成熟得到的卵母細胞仍存在發(fā)育能力較差的問題。本研究旨在探討血管內皮生長因子(VEGF)對水牛卵母細胞體外成熟及其后續(xù)胚胎發(fā)育的影響，并初步研究其相關作用機制，以期進一步完善水牛體外成熟培養(yǎng)體系，提高體外胚胎生產(chǎn)效率。本研究主要內容包括：
　　 ⑴探討了VEGF及其受體VEGFR1與VEGFR2在卵泡發(fā)育和卵丘卵母細胞復合物(COCs)體外成熟培養(yǎng)過程中的表達變化規(guī)律。VEGF在

2、卵巢組織表達的免疫組織化學檢測結果發(fā)現(xiàn)，不同時期卵泡中均有VEGF表達，且主要在顆粒細胞中表達。水牛COCs中VEGF表達情況的免疫熒光染色檢測結果顯示，VEGF主要在卵丘細胞中表達，在卵母細胞不表達。水牛COCs在體外成熟過程中的VEGF及其受體表達變化實時熒光定量PCR(Q-PCR)檢測結果發(fā)現(xiàn)，VEGF在成熟培養(yǎng)過程中(0h、6h、12 h與24 h)的表達呈下降趨勢，其中VEGF在成熟前(0h)表達量顯著高于成熟6 h(P＜0.

3、05)，而成熟6h、12h與24 h間VEGF表達量差異不顯著(P＞0.05);VEGFR1與VEGFR2在成熟過程中均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，其中VEGFR1表達量在成熟6h時達到最高值，VEGFR2在成熟12h表達量達到最大。
　　 ⑵探討了不同濃度VEGF對水牛卵母細胞體外成熟及其后續(xù)胚胎發(fā)育的影響，并對其作用機制進行初步研究。結果發(fā)現(xiàn):在體外成熟培養(yǎng)中添加5 ng/ml的VEGF能顯著提高卵母細胞的成熟率(34.81％ v

4、s43.73％，P＜0.05)及其后續(xù)體外受精和核移植胚胎的卵裂率(35.11％ vs44.81％;48.65％ vs86.27％，P＜0.05)與囊胚率(11.45％ vs20.18％，18.92％ vs31.69％，P＜0.05)，但VEGF對裸卵體外成熟無顯著影響(22.67％ vs18.18％，P＞0.05)。COCs體外成熟后卵丘細胞凋亡的TUNEL檢測結果發(fā)現(xiàn)，添加濃度為5 ng/ml的VEGF能顯著降低卵丘細胞凋亡率(P＜

5、0.05);體外成熟過程中COCs凋亡(bax、bcl2、birc4、caspase-3與fas)與發(fā)育(CX37、PTGS2、CX43、CYP11A1、CYP19A1、PCNA、CCNB、FSHR、MAPK、VEGFR1與VEGFR2)相關基因表達情況的Q-PCR檢測結果發(fā)現(xiàn)，添加濃度為5 ng/ml的VEGF能顯著提高卵丘細胞birc4、CX37、CYP11A1與PGES的mRNA水平（P＜0.05），顯著降低凋亡因子caspase

6、-3與fas的mRNA水平（P＜0.05），對bcl2、bax、CX43、CY19A1、PCNA、FSHR、MAPK、CCNB、PTGS2、VEGFR1與VEGFR2的mRNA表達無影響。
　　 ⑶上述結果表明：VEGF在水牛卵泡各個時期均有表達，且主要在顆粒細胞中表達，在卵母細胞中不表達；內源性的VEGF在水牛COCs體外成熟過程中呈現(xiàn)出下降趨勢，而VEGFR1與VEGFR2均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；體外成熟培養(yǎng)液中添加5 n

7、g/ml的VEGF有利于提高水牛卵母細胞的成熟及其后續(xù)早期胚胎的發(fā)育能力，但對裸卵的成熟無影響；添加濃度為5ng/ml VEGF不但能抑制水牛COCs中卵丘細胞的凋亡，而且能促進卵丘細胞birc4、CX37、CYP11A1與PGES的mRNA表達水平，降低caspase-3與fas的mRNA水平，但對bcl2、bax、CX43、CY19A1、PCNA、FSHR、MAPK、CCNB、PTGS2、VEGFR1與VEGFR2的mRNA表達無影