BCL2L10對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響.pdf

1、BCL2L10是一種抗細(xì)胞凋亡的BCL-2家族成員，研究表明，其大量而特異性的表達(dá)于成年人和小鼠的卵母細(xì)胞及早期胚胎，對(duì)卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育起到重要的促進(jìn)作用。本研究旨在探討水牛BCL2L10在水牛各組織中的表達(dá)及其對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響，以期進(jìn)一步明確水牛卵母細(xì)胞的成熟機(jī)理，為提高水牛卵母細(xì)胞體外成熟率提供一定的理論指導(dǎo)意義。本研究包括三個(gè)試驗(yàn):
　　1.水牛BCL2L10基因的克隆及其在各組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，克

2、隆所得的基因?yàn)?00 bp，編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為558 bp，共編碼185個(gè)氨基酸。序列分析顯示克隆所得基因的核苷酸序列與牛、綿羊、小鼠、野豬、人的同源性較高，氨基酸序列同源性較低，表明BCL2L10蛋白在不同物種間發(fā)生了一定的進(jìn)化;通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)BCL2L10蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)水牛BCL2L10蛋白為跨膜性蛋白，通過(guò)C端跨膜結(jié)構(gòu)域錨定在細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜上，屬于BCL-2蛋白家族成員，可能參與細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程。實(shí)時(shí)熒光定量試

3、驗(yàn)結(jié)果表明，水牛BCL2L10基因主要表達(dá)在卵巢組織中，在睪丸組織中也有少量的表達(dá)，而在其他組織中未檢測(cè)到表達(dá)，而其對(duì)立互作對(duì)象BAX基因在水牛各個(gè)組織中均能檢測(cè)到表達(dá)。
　　2.水牛BCL2L10及其對(duì)立互作對(duì)象BAX在卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育中的表達(dá)。利用免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等手段檢測(cè)BCL2L10及BAX在水牛卵巢、卵母細(xì)胞成熟過(guò)程及各階段早期胚胎中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，水牛BCL2L10蛋白在卵

4、巢中的表達(dá)主要集中在卵母細(xì)胞上，顆粒細(xì)胞與卵丘細(xì)胞上無(wú)表達(dá)。在水牛卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中BCL2L10均有表達(dá)，且表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，而B(niǎo)AX基因的表達(dá)在此過(guò)程中沒(méi)有明顯的變化。在水牛早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，BCL2L10基因的表達(dá)呈現(xiàn)一個(gè)先上調(diào)再下調(diào)的趨勢(shì)，且在8細(xì)胞期表達(dá)量最高，而B(niǎo)AX基因在8細(xì)胞前低表達(dá)，8細(xì)胞后快速上調(diào)，在囊胚期表達(dá)量最高。
　　3.利用siRNA干擾技術(shù)抑制BCL2L10基因的表達(dá)對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響。利用

5、陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)GⅤ期水牛卵母細(xì)胞，探討下調(diào)水牛卵母細(xì)胞BCL2L10基因的表達(dá)后對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外第一級(jí)體排出率和孤雌激活卵裂率的影響。結(jié)果表明，利用siRNA干擾技術(shù)可以有效的抑制水牛卵母細(xì)胞BCL2L10基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，與空白組和陰性對(duì)照組相比，下調(diào)BCL2L10基因的表達(dá)可以使水牛卵母細(xì)胞的體外成熟率及孤雌激活卵裂率顯著下降(48.18％、46.65％ vs33.5％;54.72％、61.32％ vs

6、37.52％,p＜0.01)。同時(shí)，對(duì)BAX、BCL-2、Caspase-3、Caspase-9四個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證下調(diào)BCL2L10基因表達(dá)后對(duì)凋亡相關(guān)基因的影響。結(jié)果表明下調(diào)BCL2L10基因的表達(dá)后Caspase-9基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)(p＜0.05)，細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序。
　　綜上所述，(1)水牛BCL2L10基因編碼區(qū)為558 bp，共編碼185個(gè)氨基酸，BCL2L10蛋白在不同物種間發(fā)生了一定的進(jìn)化，且主