褪黑素對水牛卵母細胞體外成熟的影響及其機制的探究.pdf

1、褪黑素是松果腺分泌的一種多功能分子，它不僅能調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律和季節(jié)性動物繁殖，而且在調(diào)節(jié)動物生殖方面也起著重要的作用。研究證明，褪黑素對卵泡的發(fā)育、卵母細胞的成熟和胚胎發(fā)育起著重要的作用。本研究主要是探討外源性褪黑素對水牛卵母細胞體外成熟的影響，并對其相關(guān)作用機制進行探究，以期進一步優(yōu)化卵母細胞體外成熟的培養(yǎng)體系，為闡明水牛卵母細胞成熟的機制提供一定的理論依據(jù)。
　　首先，檢測了水牛卵丘細胞和卵母細胞上褪黑素的兩種受體MT1和MT2的

2、表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在水牛卵丘細胞和卵母細胞上均存在褪黑素受體MT1和MT2。
　　其次，探究了在體外成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度褪黑素(0M、10-9M、10-8M、10-7M)對水牛卵母細胞體外成熟及其隨后體外受精胚胎的發(fā)育的影響。結(jié)果顯示:水牛卵母細胞在添加不同濃度的褪黑素（10-9M、10-8M、10-7M）的成熟液中成熟培養(yǎng)22～24h后，每個處理組的卵母細胞第一極體排出率均顯著高于未添加組(50.30％ vs47.56％、

3、53.04％ vs47.56％、50.63％ vs47.56％，P＜0.05)，且濃度為10-8M組卵母細胞的極體排出率顯著高于10-9M和10-7M組(P＜0.05)。隨后，將各組成熟培養(yǎng)24 h后的卵母細胞進行體外受精，發(fā)現(xiàn)受精后各處理組胚胎的分裂率顯著高于未添加組(60.23％ vs57.62％、65.26％ vs57.62％、62.84％ vs57.62％,P＜0.05)，而且10-8M和10-7M組的胚胎能發(fā)育到囊胚的比例顯著

4、高于未添加組(20.48％ vs15.22％、18.68 vs15.22％，P＜0.05)，但10-9M組的囊胚發(fā)育率與未添加組相比差異不顯著(16.44％ vs15.22％，P＞0.05)。
　　最后，探討了褪黑素對卵母細胞成熟影響的作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在成熟液中單獨添加同等濃度的褪黑素受體拮抗劑(LZU，108M)，水牛卵母細胞成熟培養(yǎng)后的極體排出率(47.44％ vs48.15％)、體外受精后胚胎分裂率(57.18％ vs5

5、8.42％)和囊胚率(15.06％ vs15.26％)與未添加組相比，差異不顯著(P＞0.05);而單獨添加同等濃度的褪黑素受體激動劑(ⅡK7，10-8M)時，水牛卵母細胞成熟培養(yǎng)后的極體排出率(51.25％ vs48.15％)、體外受精后胚胎分裂率(64.15％ vs58.42％)和囊胚率(19.04％ vs15.26％)均顯著高于未添加組(P＜0.05)，但與單獨添加褪黑素組(MT，10-8M)卵母細胞的極體排出率(51.25％ v

6、s52.94％)、體外受精后胚胎的分裂率(61.24％ vs64.32％)和囊胚率(18.52％ vs19.36％)相比，差異不顯著(P＞0.05);當同時添加褪黑素(MT，10-8M)和褪黑素受體拮抗劑(LZU，10-8M)時，水牛卵母細胞成熟后的極體排出率(48.19％ vs48.15％)、體外受精后胚胎的分裂率(58.13％ vs58.42％)和囊胚率(15.23％ vs15.26％)與未添加組相比，差異不顯著(P＞0.05)。對

7、卵母細胞活性氧進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)褪黑素處理組卵母細胞成熟后細胞內(nèi)的活性氧含量顯著低于未添加的對照組(P＜0.05)。利用激光共聚焦顯微鏡檢測卵母細胞線粒體的分布和線粒體膜電位的變化情況，結(jié)果顯示:褪黑素處組水牛卵母細胞線粒體呈擴散型分布的數(shù)量及線粒體的膜電位均顯著高于未添加組(P＜0.05)。利用酶標檢測cAMP、cGMP、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶含量的變化，發(fā)現(xiàn)褪黑素處理組的卵母細胞內(nèi)cAMP的含量顯著低于未添加組，而cGMP、

8、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的含量顯著高于未添加組(P＜0.05)。熒光定量PCR檢測抗氧化基因GPX4和SOD1、卵丘擴展相關(guān)基因PTX3和HAS1、HAS2以及褪黑素受體基因MT1和MT2的表達情況，結(jié)果顯示:經(jīng)褪黑素處理能顯著上調(diào)水牛卵母細胞GPX4、SOD1、MT1和MT2的表達，而且也顯著上調(diào)了卵丘細胞上卵丘擴展相關(guān)基因PTX、HAS1、HAS2以及褪黑素受體基因MT1和MT2的表達水平(P＜0.05)。
　　上述結(jié)果