HaS-miR-30e、HaS-miR-192對HaCaT細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子的調(diào)控.pdf

1、目的:探討人工構(gòu)建的hsa-miR-30e和hsa-miR-192二條microRNA對人HaCaT細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的調(diào)控作用，預(yù)測hsa-miR-30e和hsa-miR-192在銀屑病領(lǐng)域的應(yīng)用前景。
　　 方法:培養(yǎng)人永生角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞株)，培養(yǎng)完成后進(jìn)行細(xì)胞鋪板，本次實(shí)驗(yàn)設(shè)有hsa-miR-30e模擬物組、hsa-miR-30e抑制物組、hsa-miR-192模擬物組、hsa-miR-19

2、2抑制物組、模擬物陰性對照組、抑制物陰性對照組和空白對照組共7組，根據(jù)需要做好復(fù)孔，然后加入轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，再用MTT法檢測HaCaT細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞轉(zhuǎn)染的成果，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中VEGF基因的mRNA水平，ELISA法觀察hsa-miR-30e和hsa-miR-192對VEGF蛋白表達(dá)水平的調(diào)控效應(yīng)。
　　 結(jié)果:MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示hsa-miR-30e模擬物、hsa-miR-30e抑制物、

3、hsa-miR-192模擬物、hsa-miR-192抑制物、模擬物陰性對照和抑制物陰性對照六組24h、48h、72h的細(xì)胞增殖活性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并且可在鏡下觀察到細(xì)胞生長狀態(tài)良好，代表轉(zhuǎn)染效果也十分良好。又可看出隨著時(shí)間的推移細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，到72h時(shí)達(dá)到最高，說明轉(zhuǎn)染率在72h最高。在24h時(shí)，可看出hsa-miR-192模擬物和hsa-miR-192抑制物兩組間的細(xì)胞增殖抑制率沒有明顯差別，猜測可能兩者間差異

4、不大，其它各組間細(xì)胞增殖抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。48h時(shí)，hsa-miR-30e模擬物和hsa-miR-30e抑制物兩組和空白對照組相比細(xì)胞增殖抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但兩者之間P＞0.05。但hsa-miR-192模擬物、hsa-miR-192抑制物和空白對照組各組間細(xì)胞增殖抑制率均P＜0.05?？赡茈S著時(shí)間的推移，轉(zhuǎn)染的效果會更加明顯，組間會有些許的波動。72h時(shí)，只有hsa-miR-30e模擬物和hsa-miR-30e抑制物、hsa-mi

5、R-192模擬物和hsa-miR-192抑制物相比較細(xì)胞增殖抑制率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其它各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測隨著細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到最高，轉(zhuǎn)染率也達(dá)到最高，效果最明顯，細(xì)胞也趨于穩(wěn)定，達(dá)到最佳狀態(tài)，促使各組間差異體現(xiàn)明顯。qRT-PCR結(jié)果顯示hsa-miR-30e模擬物組的2-△△Ct均值為(6.04±0.07)，說明提高了hsa-miR-30e豐度的VEGF基因的mRNA的表達(dá)高于正常的VEGF基因的mRNA的表達(dá)的(6.04±0

6、.07)倍。hsa-miR-192模擬物和hsa-miR-192抑制物的VEGF基因的mRNA的表達(dá)沒有檢測出來，推測可能此條miRNAs不通過VEGF信號通路調(diào)控。ELISA結(jié)果顯示hsa-miR-30e模擬物、hsa-miR-30e抑制物、模擬物陰性對照、抑制物陰性對照和空白對照組各組間的VEGF蛋白表達(dá)水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步說明hsa-miR-30e在HaCat細(xì)胞中通過VEGF信號通路表達(dá)上調(diào)。hsa-miR-192模擬物、

7、hsa-miR-192抑制物、模擬物陰性對照、抑制物陰性對照和空白對照組各組間的VEGF蛋白表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步說明可能此條miRNAs不通過VEGF信號通路調(diào)控。
　　 結(jié)論:銀屑病是一種遺傳基因異常性疾病，轉(zhuǎn)錄水平上的hsa-miR-30e可靶向負(fù)調(diào)控大量mRNA，而這個(gè)被調(diào)控的mRNA與其它mRNA又存在錯(cuò)綜復(fù)雜的相互影響和作用，共同形成網(wǎng)絡(luò)式的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)通過多種途徑來參與銀屑病的發(fā)生。而hsa-miR-192可能