miR-210促進(jìn)小鼠BMMSCs血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)和分泌.pdf

1、目的：研究小分子非編碼RNA miR-210對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)表達(dá)和分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的影響，為骨組織工程血管化研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法：首先體外全骨髓液貼壁法培養(yǎng)小鼠 BMMSCs，通過(guò)構(gòu)建慢病毒載體Lenti-LacZ和 Lenti-miR-210，分別轉(zhuǎn)染小鼠 BMMSCs和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)；MTT法檢測(cè)慢病毒載體對(duì)小鼠 BMMSCs增殖情況的影響；Lenti-miR-21

2、0/BMMSCs和 Lenti-LacZ/BMMSCs于轉(zhuǎn)染慢病毒載體后培養(yǎng)至第7d RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA基因表達(dá)，第14d Western blot檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)；通過(guò)PKH26紅色熒光染料對(duì)Lenti-miR-210/HUVEC和Lenti-LacZ/HUVEC進(jìn)行染色后，進(jìn)行24h Matrigel成管實(shí)驗(yàn)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察成管效果，統(tǒng)計(jì)兩組成管長(zhǎng)度；構(gòu)建HyStem-HP凝膠緩釋系統(tǒng)，agomir-210和

3、agomir-NC與BMMSCs復(fù)合 HyStem-HP凝膠后行裸鼠皮下注射,7d后取標(biāo)本進(jìn)行10%中性福爾馬林固定，脫水后包埋，石蠟切片行CD31免疫熒光染色，檢測(cè)CD31陽(yáng)性細(xì)胞含量。使使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式呈現(xiàn)，t檢驗(yàn)和方差分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。
　　結(jié)果：全骨髓液培養(yǎng)后5-7d，鏡下見(jiàn)部分細(xì)胞呈梭形或多角形，散在分布；傳代后貼壁細(xì)胞呈梭形旋渦狀生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)隨傳

4、代培養(yǎng)逐漸一致；miR-210慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠BMMSCs和HUVEC，當(dāng)MOI=10時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，MTT法檢測(cè)病毒對(duì)BMMSCs增殖無(wú)影響，Lenti-miR-210和Lenti-LacZ兩組細(xì)胞培養(yǎng)第7d RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA基因表達(dá)結(jié)果，miR-210促進(jìn)小鼠BMMSCs VEGF的表達(dá)（P＜0.01)；第14d Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)，miR-210組VEGF蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照

5、組，與 RT-PCR結(jié)果一致；Matrigel成管實(shí)驗(yàn)24h結(jié)果 Lenti-miR-210組與 Lenti-LacZ相比，環(huán)形管狀結(jié)構(gòu)明顯，端端接觸多，管壁更完整；統(tǒng)計(jì)小管長(zhǎng)度后比較兩組小管長(zhǎng)度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；agomir-210和agomir-NC分別與BMMSCs復(fù)合HyStem-HP凝膠緩釋系統(tǒng)裸鼠皮下注射7d后標(biāo)本CD31免疫熒光染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析顯示agomir-210組CD31陽(yáng)性細(xì)胞含量明顯高于agom