siRNA干擾人胃癌細胞株SGC-7901 COX-2的表達抑制胃癌復發(fā)和肝轉移的臨床和實驗研究.pdf

1、第一部分COX-2和Ki-67及MVD在胃癌組織中的表達及其與胃癌肝轉移及胃癌復發(fā)關系的研究 目的：研究胃癌組織中COX-2、Ki-67的表達和微血管密度(MVD)，探討與胃癌肝轉移和胃癌復發(fā)關系密切的臨床病理因素和免疫生化指標，探索胃癌肝轉移和復發(fā)的規(guī)律，為胃癌治療和隨訪提供指導。 方法：回顧性分析手術切除的胃癌肝轉移病例31例和48例胃癌復發(fā)病例的病理特征，并任取48例無肝轉移、無復發(fā)病例作對照組。用免疫組織化學方法

2、檢測胃癌標本中COX-2、Ki-67的表達和微血管密度(MVD)，并分析三者之間及其與臨床病理因素之間的相關性。用單因素和多因素分析研究影響胃癌肝轉移和胃癌復發(fā)的相關因素。 結果 (1)全組胃癌COX-2蛋白陽性率為88.2％，肝轉移組、復發(fā)組和對照組分別為100％、85.4％和83.3％，而且肝轉移組、復發(fā)組和對照組強陽性率分別為83.9％、52.1％和29.2％。 (2)COX-2、Ki-67LI和MVD相互

3、之間具有極強的相關性，并且三者都與腫瘤的浸潤深度、TNM分期、肝轉移、淋巴結轉移和周圍臟器受累密切相關；COX-2和Ki-67LI都與存在腹水、腹膜侵犯和Borrmann分型高度相關；除此之外，COX-2還與盆腔轉移結節(jié)、腫瘤長徑相關，MVD與胃癌復發(fā)相關，Ki-67LI與腫瘤長徑、漿膜浸潤情況和腫瘤細胞的分化程度都存在具有統(tǒng)計學意義的相關性。 (3)胃癌病例有腹水存在、盆腔轉移結節(jié)形成、侵犯腹膜、腫瘤部位在胃體或全胃、淋巴結轉

4、移、累及周圍臟器以及腫瘤TNM分期Ⅲ或Ⅳ期、浸潤深度T4期、COX-2強陽性、MVD增加者肝轉移明顯增加，是胃癌肝轉移的危險因素；侵犯腹膜、盆腔轉移結節(jié)、TNM分期和MVD是胃癌肝轉移最重要的四個影響因素。浸潤深度、盆腔轉移結節(jié)、COX-2蛋白強陽性和MVD與胃癌復發(fā)密切相關，是胃癌復發(fā)的高危因素。 (4)對照組、復發(fā)組和肝轉移組胃癌生存率比較有極顯著差異，與對照組相比較，復發(fā)組和肝轉移組胃癌生存率明顯減低，均有極顯著統(tǒng)計學意義

5、差異。初發(fā)胃癌的浸潤深度、盆腔轉移結節(jié)、存在腹水以及胃癌標本中COX-2含量增高是胃癌術后生存率降低的危險因素。 結論 (1)腹膜侵犯、盆腔轉移結節(jié)、TNM分期和MVD是影響胃癌肝轉移最重要的因素，浸潤深度、盆腔轉移結節(jié)、COX-2蛋白強陽性和MVD與胃癌復發(fā)密切相關，是胃癌復發(fā)的高危因素。 (2)COX-2與Ki-67LI和MVD相互之間具有極強的相關性，并且三者都與腫瘤的浸潤深度、TNM分期、肝轉移、淋巴結轉

6、移和周圍臟器受累密切相關。 (3)COX-2、浸潤深度、盆腔轉移結節(jié)和存在腹水是影響胃癌病人生存率的主要因素，與胃癌病人的預后有關。 (4)檢測臨床病理和生物化學指標可能預測胃癌肝轉移和胃癌復發(fā)的發(fā)生，靶向于COX-2和微血管形成的治療可能提高胃癌病人的預后。 第二部分RNA干擾靶向抑制胃癌SGC-7901細胞COX-2基因和蛋白表達方法的建立 目的：應用特異、高效并且方法簡單的RNAi技術，選擇在胃腸道

7、腫瘤中廣泛存在、與腫瘤細胞生物學特性(腫瘤細胞的增生、凋亡、侵襲和粘附)息息相關，影響胃癌的發(fā)生和發(fā)展的COX-2作為靶點，建立有效的RNA干擾方法。 方法購置和培養(yǎng)高轉移性胃癌細胞株SGC7901細胞，對其COX-2基因進行克隆、鑒定和測序，并與基因庫中COX-2基因進行序列對比。根據所克隆COX-2基因用Sfold軟件設計了6條針對COX-2基因不同部位的siRNA，同時設計一條陰性對照siRNA，將選擇的序列和相應的基因組

8、數據庫(人、小鼠、大鼠等)進行BLAST序列比對，確信所選擇的序列與其他的基因不具有同源性，并用化學方法合成。 結果 (1)測序結果表明：胃癌SGC7901細胞中克隆的COX2基因經拼合后有1931bp，所克隆序列和genbank中COX-2標準序列(genebankNo.NM_000963)對比顯示：共6處7個堿基不同，沒有缺失和插入。 (2)lipofectamin2000和TOPtransfection介導

9、的pcDNA3.1/His/lacZ質粒和pcDNA3.1/His/lacZ/siRNA可以有效的轉染肝癌HepG2細胞，細胞轉染率分別達到56％和68％。lipofectamin2000和TOPtransfection介導的pcDNA3.1/His/lacZ質粒和pcDNA3.1/His/lacZ/siRNA可以有效轉染胃癌SGC7901細胞，細胞轉染率分別達到49％和55％。因此選擇TOPtransfection介導COX-2-si

10、RNA，進行靶向抑制胃癌SGC7901細胞COX-2表達的實驗研究。 (3)COX-2(0-5)和陰性對照siRNA轉染胃癌SGC7901細胞24hr后，測得COX-2mRNA拷貝數分別為3.5、4.75、11.53、6.45、17.08、12.33和209.1，與陰性對照相比，每條siRNA都有很好的基因敲除效果，最強干擾效果達98.3％，最低也在90％以上；COX-20-siRNA轉染胃癌7901細胞后24hr干擾效果最好，

11、與對照組相比，抑制COX-2mRNA表達96.9％，48hr和72hr抑制率分別為86.3％和41.9％；0.2ug、0.4ug和0.6ugCOX20-siRNA轉染胃癌7901細胞24hr后COX2mRNA表達的抑制率分別為96.9％、96.1％和97.6％；COX-20-siRNA轉染胃癌7901細胞后24hrCOX-2蛋白抑制率為71.5％。 結論 (1)本研究證實高轉移性胃癌細胞株SGC-7901細胞中能克隆出完

12、整的COX-2基因，其序列與文獻報道一致。 (2)TOPtransfection介導報告基因pcDNA3.1/His/lacZ質粒轉染胃癌SGC-7901細胞和肝癌HepG2細胞以及轉染報告基因siRNA(pcDNA3.1/His/lacZ/siRNA)對報告基因lacZ的抑制效果優(yōu)于lipofectamin2000。 (3)TOPtransfection介導的COX-2-siRNA能夠有效抑制胃癌SGC7901細胞中C

13、OX-2基因和蛋白的表達，這種抑制效果在轉染后24hr最強，隨著時間的推遲抑制效果減弱，但是不隨siRNA濃度的變化而波動。 第三部分靶向COX-2的RNA干擾對胃癌SGC-7901細胞和裸鼠皮下種植瘤生長的抑制作用 目的：在建立有效的RNA干擾方法的基礎上，探討靶向COX-2的RNA干擾對胃癌SGC-7901細胞增生和凋亡的影響以及對裸鼠皮下種植瘤的抑制作用，建立胃癌及其復發(fā)和轉移基因治療的新方法。 方法COX

14、-20-siRNA和陰性對照siRNA轉染胃癌SGC-7901細胞后24hr，用熒光定量PCR和Westernblotting方法檢測細胞中COX2mRNA拷貝數和蛋白含量，同時用流式細胞儀檢測胃癌細胞凋亡情況，并與未經轉染的胃癌細胞做對比。同樣用三組細胞接種裸鼠皮下，8周后處死裸鼠，剝離瘤體，測量腫瘤體積、重量和抑瘤率；同時用熒光定量PCR和Westernblotting檢測皮下種植瘤中COX-2mRNA拷貝數以及COX-2和ki-6

15、7蛋白的表達。 結果 (1)與對照組和陰性對照組相比，實驗組胃癌細胞有很好的基因敲除效果，干擾效果達到97.8％和97.7％；陰性對照組COX-2蛋白無明顯變化，實驗組COX-2蛋白抑制率為70.9％。 (2)實驗組、陰性對照組及對照組胃癌細胞凋亡率分別為(n=8)：22.28±3.62、1.23±0.27和1.03±0.14。試驗組與陰性對照組(t=14.214，P=0.000)和對照組(t=14.378，P=

16、0.000)比較，均具有極顯著差異，陰性對照組與對照組比較(t=1.635，P=0.133)沒有統(tǒng)計學意義。 (3)實驗組、陰性對照組及對照組裸小鼠皮下種植瘤平均體積1367.2±665.2、3011.4±966.8和3108.6±1006.3mm3，試驗組、陰性對照組及對照組裸小鼠皮下種植瘤平均重量分別為1.24±0.86g、2.57±1.43g和2.66±1.65g，按體積和重量計算，與對照組和陰性對照組相比，實驗組裸小鼠皮

17、下種植瘤抑瘤率分別為56.0％和3.1％以及54.4％和3.4％。實驗組COX-2mRNA表達明顯降低，有很好的基因敲除效果，與對照組和陰性對照組相比干擾效果分別達到67.8％和66.4％。與對照組比較，陰性對照組COX-2蛋白和ki-67蛋白均無明顯變化，實驗組COX-2蛋白和ki-67蛋白抑制率分別為56.7％和51.8％。 結論(1)靶向COX-2的RNA干擾能有效抑制胃癌SGC7901細胞中COX-2基因和蛋白表達。