RNA干擾阻斷MIF基因表達抑制肝癌細胞增殖和遷移的分子機制研究.pdf

1、肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是人類最常見的惡性腫瘤之一，每年約有40-50萬新發(fā)病例。我國肝癌的死亡率僅次于胃癌和食道癌位于第三位，每年約有10萬人死于該病。HCC多見于青壯年男性，經(jīng)診斷后平均存活期約為6個月。盡管近年來早期肝癌發(fā)現(xiàn)率的提高以及治療技術(shù)的進步使肝癌的死亡率有所降低，但由于HCC復(fù)發(fā)率高，容易發(fā)生肝內(nèi)及肝外轉(zhuǎn)移，常規(guī)放化療效果不佳，故HCC病人總體預(yù)后不良。HCC的復(fù)發(fā)和高死亡率

2、與腫瘤細胞快速增殖、多結(jié)節(jié)生長，血管侵潤，易血道轉(zhuǎn)移等諸多因素相關(guān)，因此，對HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機制的進一步研究將利于尋求分子靶標并探索新的治療方法。
　　 巨噬細胞移動抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF）最初是作為激活的淋巴細胞產(chǎn)生的一種可溶性淋巴因子被發(fā)現(xiàn)。其具有抑制巨噬細胞移走﹑粘俯和吞噬的功能。近來的研究表明，MIF在多種腫瘤細胞中過度表達，提示MIF與腫瘤的

3、發(fā)生關(guān)系密切。多項研究發(fā)現(xiàn)，MIF參與了HCC發(fā)生和發(fā)展。
　　 隨著后基因組時代的到來，越來越多基因的功能被揭示，許多與疾病相關(guān)的基因及治療的有效靶點被確認。利用RNA干涉技術(shù)沉默致病基因，可實現(xiàn)快速、高效、特異的基因治療。有文獻報道應(yīng)用siRNA阻斷Survivin、Cyclin E的表達可抑制肝癌細胞增殖。關(guān)于應(yīng)用siRNA阻斷MIF表達來研究MIF控制HCC發(fā)生和發(fā)展的機制，至今為止尚未見另有文獻報道。
　　 本

4、研究以免疫組織化學研究HCC組織中MIF和cyclinD1的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系為基礎(chǔ)，進一步應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，化學合成與MIF mRNA匹配的雙鏈小干擾RNA(siRNA)，轉(zhuǎn)染HCC細胞系，特異地阻斷或抑制MIF表達。用免疫印跡方法和免疫熒光檢測MIF表達及有關(guān)細胞增殖及存活信號分子MAPK/ERK﹑ AKT、GSK3β、CyclinD1和Cdk4/6等的表達；定量RT-PCR檢測MIF和cyclinD1 mRNA變化；細

5、胞增殖和遷移實驗觀測肝癌細胞行為學的改變；接種MIF siRNA和對照siRNA轉(zhuǎn)染的HCC細胞于裸鼠皮下，觀察比較皮下腫瘤生長的體積。通過探討肝癌細胞自分泌MIF參于控制癌細胞增殖﹑遷移以及血管生成的分子機制，我們期望通過利用特異的siRNA阻斷MIF表達從而抑制肝癌細胞生長和轉(zhuǎn)移，揭示其相關(guān)機制并為臨床治療HCC和開發(fā)新一類抗腫瘤藥物提供有價值的實驗依據(jù)。
　　 第一部分 巨噬細胞移動抑制因子和細胞周期蛋白D1在肝細胞肝癌中

6、的表達
　　 目的：研究MIF、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）在HCC組織中的表達及其可能的關(guān)系。
　　 方法：應(yīng)用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學方法檢測93例HCC中MIF、CyclinD1的表達，分析它們的表達與HCC臨床病理特征的關(guān)系。應(yīng)用定量PCR及Western blot技術(shù)檢測MIF和Cyclin D1mRNA和蛋白觀察10例新鮮肝癌組織和癌旁組織的表達差異。
　　 結(jié)果：免疫組化結(jié)果表明，組織芯片

7、93例HCC中MIF、CyclinD1表達率分別為71％、41％。MIF和CyclinD1陽性表達率與正常肝臟組織（均為陰性）表達率之間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在≥3.5cm的腫瘤中MIF表達率為79％，明顯高于在小于3.5cm腫瘤中的表達率48％（P＜0.01）；有轉(zhuǎn)移的肝癌組織中CyclinD1陽性率62％，明顯高于無轉(zhuǎn)移病例中陽性率35％，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MIF表達強弱與CyclinD1明顯正相關(guān)（P

8、＜0.01）。
　　 MIF和Cyclin D1 mRNA在肝癌組織中的相對表達量為癌旁組織的7.31±1.85倍和4.27±1.05倍，差異均具有統(tǒng)計學意義（FMIF=111.4，P＜0.01；FCyclinD1=58.4，P＜0.01）。MIF和CyclinD1蛋白在肝癌組織中的表達量明顯高于與癌旁組織，MIF和CyclinD1蛋白在肝癌組織中的表達分別比癌旁組織高3.6±0.80倍和2.3±0.10倍（FMIF=15.5，

9、P＜0.01；FCyclinD1=87.5，P＜0.01）。
　　 結(jié)論： MIF和 CyclinD1蛋白及其mRNA在HCC中高表達。MIF的表達與CyclinD1的表達呈正相關(guān)關(guān)系，提示MIF、CyclinD1在HCC發(fā)展進程中可能起共同促進癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的作用。
　　 第二部分小RNA干擾MIF基因表達抑制肝癌細胞增殖、遷移和生長
　　 目的：研究特異性小干擾RNA（MIF siRNA）對肝癌細胞MIF基

10、因表達的抑制作用，以及MIF基因表達下降對肝癌細胞增殖和遷移的影響。
　　 方法：脂質(zhì)體方法將化學合成的MIF siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細胞PLC、HepG2。定量RT-PCR、Western blot檢測MIF mRNA和蛋白的表達。四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法、體外細胞侵襲實驗檢測細胞增殖和對重組基底膜(matrigel)穿透能力。裸鼠皮下種植siRNA轉(zhuǎn)染的肝癌細胞PLC，觀察腫瘤結(jié)節(jié)形成和增長情況至術(shù)后第20天。
　　

11、 結(jié)果：50nmol/L的MIF siRNA使PLC和HepG2細胞的MIF mRNA表達下調(diào)60.6％和72.1％，蛋白水平降低59.74％和64.84％。100 nmol/L的MIF siRNA使PLC和HepG2細胞的MIF mRNA表達下調(diào)81.3％和89.1％，蛋白水平降低69.50％、72.31％，與對照組相比較其差異有統(tǒng)計學意義（p均<0.01）。100 nmol/L MIF siRNA轉(zhuǎn)染24hr后PLC和HepG2細

12、胞MIF免疫熒光明顯減弱，MIF表達水平明顯下降；細胞增殖率分別下降16.79％和47.14％（p均<0.05）。穿透matrigel的細胞數(shù)與對照組比較分別下降41.38％和40.63％，差異有統(tǒng)計學意義（p均<0.05）。實驗組裸鼠腫瘤明顯比對照組生長緩慢，第7起發(fā)現(xiàn)腫瘤大小差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：MIF siRNA能有效抑制MIF表達及肝癌細胞增殖、遷移和生長。
　　 第三部分 siRNA阻斷MIF表達抑制

13、肝癌增殖和遷移的分子機制
　　 目的：研究探討特異性MIF siRNA抑制細胞肝癌細胞增殖和遷移的可能作用機制。
　　 方法：化學合成與MIF mRNA匹配的siRNA雙鏈，脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染人肝癌細胞PLC、HepG2等。Realtime-PCR檢測CyclinD1mRNA水平和 MIFmRNA水平的變化趨勢。 Western blot檢測ERK、AKT、GSK3β信號傳導(dǎo)通路和CyclinD1、CDK4、CDK6以及基質(zhì)

14、金屬蛋白酶-2（MMP-2）等相關(guān)的分子表達的改變。免疫印跡驗證4對HCC癌組織和癌旁組織的磷酸化ERK（p-ERK）水平
　　 結(jié)果：MIF siRNA轉(zhuǎn)染PLC和HepG2細胞24小時后，CyclinD1mRNA水平伴隨MIFmRNA水平的下降而下調(diào)，western blot結(jié)果提示CyclinD1在MIF siRNA轉(zhuǎn)染濃終度為100nM時表達下調(diào)69.4％ 81.7％。100nM MIF siRNA轉(zhuǎn)染PLC和HepG2