關(guān)于PTEN和profilin 1影響人肝癌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制研究.pdf

1、肝癌的惡性程度高，發(fā)生發(fā)展迅速，預(yù)后不良。因此對其發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制進(jìn)行研究顯得很有必要。過氧化物酶體增生物激活受體γ(peroxisomeproliferatoractivatedreceptor，PPAR)及全反式視黃酸(atRA)相關(guān)的信號通路活化都后可以對包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)揮抑制效應(yīng)，包括抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡、降低腫瘤侵襲能力等。但是，目前對這兩條信號通路分子機(jī)制的了解并不完全清楚，對其進(jìn)行研究可以為臨床治療肝癌

2、提供新的思路和治療手段。因此，我們擬從這兩條信號通路著手探討這兩條信號通路對腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響及相應(yīng)的分子機(jī)制。我們的研究分為三個部分。 第一部分PTEN參與PPARy相關(guān)信號通路抑制人肝癌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制 使用PPARγ的特異性配體(rosiglitazone，ROS)處理肝癌細(xì)胞系BEL-7404細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)ROS可以明顯抑制其遷移但對其增殖沒有顯著影響。同時，在ROS處理后，BEL-7404細(xì)胞內(nèi)的粘著斑激

3、酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)及蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB，Akt)的磷酸化水平顯著降低，然而胞內(nèi)的有絲分裂原活化激酶1／2(Mitogen-activatedproteinkinases，MAPK；extracellularsignal-regulatedkinases，ERKs)的磷酸化水平卻沒有變化。由于FAK和Akt都是抑癌基因PTEN(phosphataseandtensinhomo

4、logdeletedonchromosometen)的下游信號分子，因此我們檢測了ROS對PTEN的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROS可以上調(diào)PTEN蛋白質(zhì)，而且這種上調(diào)作用具有劑量和時間依賴性：當(dāng)使用PPARy的特異性阻斷劑BADGE(BisphenolAdiglycidylether)預(yù)處理細(xì)胞后，ROS對PTEN的上調(diào)作用不再出現(xiàn)，提示ROS上調(diào)PTEN是通過激活PPAR?來實(shí)現(xiàn)的。ROS處理后，PTEN的mRNA水平也出現(xiàn)升高，然而其基因的轉(zhuǎn)

5、錄活性卻沒有明顯上調(diào)，說明雖然激活PPAR~能夠上調(diào)PTEN的mRNA，但對蛋白的上調(diào)并非通過增加其基因轉(zhuǎn)錄來實(shí)現(xiàn)。在BEL-7404細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染PTEN的表達(dá)質(zhì)粒后能夠明顯抑制該細(xì)胞的遷移。而轉(zhuǎn)染PTEN的RNA干擾質(zhì)粒pPTENi阻斷PPAR?激活所致的PTEN上調(diào)后，ROS對BEL-7404細(xì)胞遷移的抑制作用不再出現(xiàn)。這提示PTEN的上調(diào)是ROS抑制細(xì)胞遷移所必須的。綜上所述，該部分實(shí)驗(yàn)提示：ROS與PPARγ結(jié)合后可以通過上調(diào)PT

6、EN蛋白質(zhì)水平來抑制BEL-7404細(xì)胞的遷移能力。 第二部分關(guān)于人肝癌細(xì)胞中PTEN負(fù)反饋調(diào)控的研究 為進(jìn)一步探討PTEN的調(diào)控機(jī)制，我們將GFP-PTEN表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721，發(fā)現(xiàn)較高水平的PTEN總蛋白水平導(dǎo)致內(nèi)源性PTEN蛋白質(zhì)的水平下降，提示SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)PTEN存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。同時還觀察到：GFP-PTEN表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后內(nèi)源性PTEN的基因轉(zhuǎn)錄活性和mRNA水平均出現(xiàn)明顯下

7、調(diào)，說明PTEN的負(fù)反饋調(diào)節(jié)是通過抑制基因的轉(zhuǎn)錄降低mRNA水平來實(shí)現(xiàn)的。使用Akt的持續(xù)活化質(zhì)粒myr-Akt與GFP-PTEN表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞后，盡管總的PTEN蛋白質(zhì)水平仍然很高，但內(nèi)源性PTEN未再出現(xiàn)下調(diào)；使用P13K的阻斷劑LY294002處理SMMC-7721細(xì)胞導(dǎo)致PTEN蛋白質(zhì)和mRNA水平下調(diào)，說明PTEN的負(fù)反饋調(diào)節(jié)是通過PTEN抑制P13K／Akt通路來實(shí)現(xiàn)的。另外，LY294002處理Cha

8、ngs細(xì)胞和ES-2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的PTEN也出現(xiàn)下調(diào)，提示對P13K／Akt通路的抑制下調(diào)PTEN并非SMMC-7721細(xì)胞所獨(dú)有。使用構(gòu)建的PTEN片斷突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)C端缺失突變的質(zhì)粒不能導(dǎo)致內(nèi)源PTEN的下調(diào)，而N端缺失突變質(zhì)粒可以誘導(dǎo)內(nèi)源PTEN下調(diào)，提示PTEN的C端結(jié)構(gòu)域是實(shí)現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)控所必需的。綜上所述，該部分實(shí)驗(yàn)提示：PTEN上調(diào)后抑制P13K／Akt途徑來下調(diào)自身的轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)控。第三部分Profi

9、linl參與全反式視黃酸抑制人肝癌細(xì)胞的增殖和遷移的分子機(jī)制研究 本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，atRA誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的profilin1(PFNl)上調(diào)。使用westemblot對4例肝癌和癌旁組織中的PFNl進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中的PFNl水平低于癌旁組織；對包含30例肝癌和癌旁組織的組織芯片進(jìn)行PFNl的免疫組織化學(xué)染色得到同樣的結(jié)果，提示PFNl的低表達(dá)可能與肝癌的惡性行為有關(guān)。為進(jìn)一步的探討P