應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制骨橋蛋白表達(dá)對肝癌細(xì)胞侵襲性的影響.pdf

1、目的：骨橋蛋白(OPN)是一種分泌型的磷酸化糖蛋白，在許多腫瘤中表達(dá)增高，并且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。我所前期研究發(fā)現(xiàn)OPN在肝細(xì)胞癌(HCC)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)降低細(xì)胞內(nèi)OPN的表達(dá)水平，進(jìn)一步研究OPN對人肝癌細(xì)胞侵襲性的影響，并初步探討OPN調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。方法：應(yīng)用Real-TimePCR檢測具有同一遺傳背景但不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞系MHCC97-L、MHCC97-H以及HCC-LM3中OPN的

2、表達(dá)情況。體外化學(xué)合成OPN序列特異性雙鏈RNA(OPNi．1和OPNi-2)，轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系(HCC-LM3)，應(yīng)用Real-TimePCR和Westernblot分別檢測經(jīng)RNA干擾后，OPNmRNA和蛋白表達(dá)水平的變化，篩選能特異性抑制細(xì)胞內(nèi)OPN表達(dá)的siRNA。利用特異性抑制OPN表達(dá)的siRNA轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系HCC-LM3后，通過三個(gè)體外實(shí)驗(yàn)觀察肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的改變：MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況，克隆形成實(shí)

3、驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲能力的改變。為探討OPN影響肝癌細(xì)胞侵襲能力的作用機(jī)制，應(yīng)用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分泌的侵襲相關(guān)因子：金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9和肝細(xì)胞生長因子(HGF)在細(xì)胞上清液中的蛋白水平變化，并應(yīng)用Real-TimePCR同時(shí)檢測細(xì)胞內(nèi)HGF在mRNA水平上的改變。為進(jìn)一步尋找與OPN作用相關(guān)的分子和可能的信號(hào)通路，應(yīng)用含有21,400個(gè)基因的全基因組芯片掃描特異性抑制OPN的細(xì)胞標(biāo)

4、本與對照細(xì)胞之間基因表達(dá)譜的差異。結(jié)果：MHCC97-L、MHCC97-H以及HCC-LM3三株細(xì)胞系轉(zhuǎn)移侵襲潛能逐漸增高，其細(xì)胞內(nèi)OPN表達(dá)水平也相應(yīng)增高。轉(zhuǎn)染特異性抑制OPN的siRNA(OPNi-2)后，細(xì)胞內(nèi)OPN的RNA水平降低79％，蛋白水平下降81％。體外實(shí)驗(yàn)表明，與空白對照組及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染OPNi-2抑制細(xì)胞內(nèi)OPN的表達(dá)后，HCC-LM3細(xì)胞的生長速度有所減慢，但與對照組相比沒有顯著性差異(P>0

5、．05)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組細(xì)胞相比，HCC-LM3細(xì)胞轉(zhuǎn)染OPNi-2后，克隆形成數(shù)目下降49％(P=0．005)，穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)也明顯減少(P=0．001)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染OPNi-2后，細(xì)胞分泌的MMP-2減少(P=0．017)，但MMP-9沒有明顯的變化(P=O．193)；同時(shí)，OPN被特異性抑制后，HCC-LM3細(xì)胞分泌的HGF蛋白含量明顯減少(P=0．007)，

6、但細(xì)胞內(nèi)HGFmRNA水平卻沒有明顯的改變。OPN表達(dá)被特異性抑制的細(xì)胞樣品和對照細(xì)胞之間的基因表達(dá)差異顯著，共發(fā)現(xiàn)135個(gè)表達(dá)有顯著性差異的基因，其中下調(diào)基因106個(gè)，上調(diào)基因29個(gè)。結(jié)論：不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能的HCC細(xì)胞系中OPN表達(dá)與其侵襲性高低呈正相關(guān)。OPNi-2可以特異性抑制高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系(HCC-LM3)內(nèi)OPN的表達(dá)。通過轉(zhuǎn)染OPNi-2降低OPN的表達(dá)，可顯著抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力。OPN可能是通過調(diào)節(jié)HGF和MMP-2