IL-37通過(guò)誘導(dǎo)Smad3磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)換抑制肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、本文對(duì)IL-37通過(guò)誘導(dǎo)Smad3磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)換抑制肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：IL-37基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定。
　　目的：構(gòu)建攜帶IL-37基因的重組慢病毒載體GV358-IL-37，為后續(xù)體內(nèi)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：PCR擴(kuò)增IL-37基因片段后，定向連接至已酶切線性化的慢病毒載體，獲得IL-37重組慢病毒GV358-IL-37并轉(zhuǎn)換細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞；對(duì)陽(yáng)性克隆

2、菌落行PCR鑒定；對(duì)重組質(zhì)粒測(cè)序并轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)，Western-blot檢測(cè)目的基因表達(dá)；最后將重組質(zhì)粒與慢病毒包裝系統(tǒng)一同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，藥篩法檢測(cè)病毒滴度。
　　結(jié)果：將目的基因片段行PCR擴(kuò)增后連接至線性化表達(dá)載體，陽(yáng)性轉(zhuǎn)換子PCR產(chǎn)物大小：849 bp，陰性轉(zhuǎn)換子PCR產(chǎn)物大小：185 bp，測(cè)序結(jié)果示：陽(yáng)性克隆與目的基因序列完全一致；將GV358-IL-37重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

3、293T細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)可觀察到明顯的綠色熒光，經(jīng)Western Blot檢測(cè)可觀察到30 kDa附近有特征條帶，大小與目的基因相吻合；包裝慢病毒48小時(shí)后提取并濃縮慢病毒，藥篩法測(cè)得病毒滴度為9E+5 TU/ml。
　　結(jié)論：將IL-37基因與酶切后的慢病毒載體GV358進(jìn)行定向連接，成功構(gòu)建出含有IL-37基因編碼序列的重組慢病毒載體GV358-IL-37；將其轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，行Western Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)，結(jié)果

4、顯示目的基因IL-37可成功表達(dá)；最后通過(guò)慢病毒包裝系統(tǒng)，成功獲得滴度為9E+5 TU/ml的重組慢病毒，為后續(xù)體內(nèi)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分：IL-37在肝癌中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響并初步探討其分子機(jī)制。
　　目的：觀察IL-37在人HCC細(xì)胞中的表達(dá)水平與HCC臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性，分析調(diào)控IL-37的表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞增殖的影響，并初步探討其潛在的分子機(jī)制。
　　方法：收集101例HCC新鮮組

5、織標(biāo)本，經(jīng)Real-time qPCR和IHC檢測(cè)癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中IL-37的表達(dá)水平，并用Spearman秩相關(guān)分析、Kaplan-Meier生存曲線、COX回歸分析IL-37表達(dá)與HCC臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性；Real-time qPCR和Western-blot檢測(cè)正常肝細(xì)胞系LO2，QSG-7701與HCC細(xì)胞系SMMC-7721，HepG2，Huh7， MHCC-97H的IL-37表達(dá)水平的差異；在HCC細(xì)胞中過(guò)表

6、達(dá)IL-37和SiRNA沉默IL-37的表達(dá)，CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察IL-37對(duì)HCC細(xì)胞增殖的影響；用Annexin V-FITC和PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果；Western-blot檢測(cè)c-myc，p21， cyclinB1，cdc2，cyclinA2，cyclinD1的表達(dá)。
　　結(jié)果：在101對(duì)HCC組織中有85對(duì)（85.15％) IL-37的表達(dá)水平低于對(duì)應(yīng)癌旁組織；IHC分

7、析101例HCC組織IL-37表達(dá)水平，根據(jù)染色結(jié)果分為高表達(dá)組（n=50)和低表達(dá)組（n=51)；Spearman秩相關(guān)分析示：IL-37的表達(dá)水平與腫瘤大小(P=0.046)、BCLC分期(P=0.030)、微血管侵襲(P=0.046)相關(guān)；Kaplan-Meier生存曲線示：高表達(dá)IL-37的HCC患者總生存期和無(wú)病生存期均高于低表達(dá)IL-37的HCC患者（中位總生存期46.0個(gè)月VS25.0個(gè)月，P=0.011；中位無(wú)病生存期2

8、9.0個(gè)月 VS17.0個(gè)月, P=0.007）；單因素COX回歸分析示：影響HCC總生存期的危險(xiǎn)因素是組織學(xué)分級(jí)(P=0.009)， BCLC分期(P=0.033)，微血管侵襲(P=0.030)和IL-37表達(dá)水平(P=0.013)；影響HCC無(wú)病生存期的危險(xiǎn)因素是腫瘤大小(P=0.023)，組織學(xué)分級(jí)(P=0.005)，BCLC分期(P=0.017)，微血管侵襲(P=0.009)和IL-37表達(dá)水平(P=0.009)；多因素COX回

9、歸分析示：影響HCC總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素是組織學(xué)分級(jí)(P=0.017)和IL-37表達(dá)水平(P=0.050)；影響HCC無(wú)病生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素是組織學(xué)分級(jí)(P=0.010)、微血管侵襲(P=0.046)和IL-37表達(dá)水平(P=0.045)；qRT-PCR、Western-blot結(jié)果示：HCC細(xì)胞系中IL-37的表達(dá)水平顯著低于正常肝細(xì)胞；CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示：與對(duì)照組（LV_NC）相比LV_IL1F7組可顯著抑制人HCC

10、細(xì)胞系HepG2、SMMC7721的增殖（P＜0.05）；與對(duì)照組（Si_NC）相比Si_IL1F7可顯著促進(jìn)人HCC細(xì)胞系HepG2、SMMC7721的增殖（P＜0.05）；細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)或者沉默IL-37的表達(dá)不能影響HepG2、SMMC7721細(xì)胞的凋亡（P＞0.05）；細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：LV_IL1F7可誘導(dǎo)HepG2、SMMC7721細(xì)胞G2/M期阻滯，Si_IL1F7則降低HepG2、SMMC7721細(xì)胞G

11、2/M期阻滯（P＜0.05）；Western-blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比， LV_IL1F7可顯著抑制HepG2、SMMC7721細(xì)胞c-myc，cdc2，cyclinB1的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)p21的表達(dá)（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，Si_IL1F7可顯著促進(jìn)HepG2、SMMC7721細(xì)胞c-myc，cdc2，cyclinB1的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)p21的表達(dá)（P=0.05）。
　　結(jié)論：HCC中低表達(dá)IL-37與HCC的臨床病理特

12、征及預(yù)后密切相關(guān)，并通過(guò)誘導(dǎo)HCC細(xì)胞阻滯于G2/M期抑制HCC細(xì)胞增殖，其機(jī)制與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上調(diào)c-myc，cdc2，cyclinB1，下調(diào)p21的表達(dá)有關(guān)。
　　第三部分：IL-37通過(guò)TGF-β/Smad3的磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)換抑制HCC細(xì)胞增殖的作用及分子機(jī)制研究。
　　目的：深入探討和分析TGF-β/Smad3信號(hào)通路在IL-37抑制HCC細(xì)胞增殖的作用及分子機(jī)制，并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　方法:Wes

13、tern-blot分析過(guò)表達(dá)IL-37與沉默 IL-37后， Smad3、pSmad3C、pSmad3L的表達(dá)；用含有TGF-β的培養(yǎng)基培養(yǎng)pSmad3C磷酸化抑制劑SIS3預(yù)處理的 SMMC-7721細(xì)胞，觀察過(guò)表達(dá)IL-37對(duì)pSmad3C、pSmad3L、c-myc、p21的表達(dá)影響；用含有TNF-α的培養(yǎng)基培養(yǎng)JNK磷酸化抑制劑SP600125預(yù)處理的SMMC-7721細(xì)胞，觀察過(guò)表達(dá)IL-37對(duì)pSmad3C、pSmad3L、

14、c-myc、p21的表達(dá)影響，并用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中TGF-β，IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α和MMP2的表達(dá)；CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng) TGF-β預(yù)處理的 LV_IL1F7-SMMC-7721細(xì)胞及LV_NC-SMMC-7721細(xì)胞的增殖情況；構(gòu)建裸鼠皮下成瘤動(dòng)物模型，在體內(nèi)觀察LV_IL1F7-SMMC-7721組與LV_NC-SMMC-7721組裸鼠腫瘤增殖的差異；Western-blot檢測(cè)皮下種植瘤pSmad3

15、C、pSmad3L、p21、c-myc、cdc2、cyclinB1的表達(dá)水平；ELISA法檢測(cè)裸鼠血清中TGF-β，IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α和MMP2的表達(dá)；IHC檢測(cè)101例HCC及其癌旁組織中pSmad3L的表達(dá)，并分析其與IL-37表達(dá)的相關(guān)性；Kaplan-Meier生存曲線分析pSmad3L表達(dá)與HCC臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)IL-37，對(duì)Smad3表達(dá)無(wú)影響，但可顯

16、著抑制pSmad3L的表達(dá)水平，上調(diào)pSmad3L的表達(dá)，沉默IL-37則可促進(jìn) pSmad3L的表達(dá)水平，抑制 pSmad3C的表達(dá)；TNF-α處理SMMC-7721LV_NC細(xì)胞可激活pSmad3L/c-myc信號(hào)，抑制pSmad3C/p21信號(hào)，但SMMC-7721LV_IL1F7細(xì)胞中pSmad3L/c-myc信號(hào)表達(dá)受到抑制，而pSmad3C/p21信號(hào)表達(dá)顯著增強(qiáng)；過(guò)表達(dá)IL-37對(duì)JNK以及pJNK的表達(dá)無(wú)影響；與對(duì)照組相

17、比， JNK抑制劑 SP600125預(yù)處理SMMC-7721LV_NC和SMMC-7721LV_IL1F7細(xì)胞后，再加TNF-α處理細(xì)胞， pSmad3L/c-myc信號(hào)表達(dá)受到抑制，而pSmad3C/p21信號(hào)表達(dá)顯著增強(qiáng)；TGF-β處理SMMC-7721LV_NC和SMMC-7721LV_IL1F7細(xì)胞，pSmad3C/p21信號(hào)表達(dá)均顯著增強(qiáng)，但SMMC-7721LV_IL1F7與對(duì)照組SMMC-7721LV_NC相比，pSmad

18、3L/c-myc信號(hào)表達(dá)仍受到抑制；用TGF-β1依賴(lài)的Smad3磷酸化特異性抑制劑SIS預(yù)處理SMMC-7721LV_NC和SMMC-7721LV_IL1F7細(xì)胞，再用TGF-β處理各組細(xì)胞，SMMC-7721LV_IL1F7組pSmad3L/c-myc信號(hào)表達(dá)受到抑制，但SMMC-7721LV_NC組pSmad3C/p21信號(hào)表達(dá)無(wú)變化， ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清結(jié)果示：SMMC-7721LV_ IL1F7組與SMMC-7721L

19、V_NC組相比，TGF-β表達(dá)水平明顯升高，IL-6, IL-8, IL-1β, TNF-α和MMP2表達(dá)水平顯著下降；CCK-8實(shí)驗(yàn)示：SIS預(yù)處理，可減弱 IL-37對(duì)腫瘤增殖的抑制作用；裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：SMMC-7721LV_IL1F7組，皮下種植瘤的體積（P=0.02），重量（P=0.004）顯著小于對(duì)照組；WB結(jié)果示：SMMC-7721LV_IL1F7組pSmad3L/c-myc, Cyclin B1, cdc2的表達(dá)顯

20、著下調(diào)，pSmad3C/p21的表達(dá)顯著上調(diào)；ELISA結(jié)果示：SMMC-7721LV_IL1F7組與對(duì)照組相比，TGF-β表達(dá)水平明顯升高IL-6, IL-8, IL-1β, TNF-α和MMP2表達(dá)水平顯著下降；IHC結(jié)果示：IL-37與pSmad3L的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.3315,P=0.0007）, Kaplan-Meier生存分析結(jié)果示：高表達(dá)pSmad3L的患者OS， DFS時(shí)間均低于低表達(dá)pSmad3L的患者。